1. Một số thơng tin về hóa chất bảo vệ thực vật
3.1. Tối ƣu hóa các điều kiện xác định chlorothalonil và diafenthiuron
3.1.1. Điều kiện phân tích của sắc ký lỏng hiệu năng cao
3.1.1.1. Lựa chọn cột phân tích
Cột tách là trái tim của hệ sắc ký, nó đóng góp một phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách. Các chất chlorothalonil và diafenthiuron là các chất kém phân cực, do đó cột tách đƣợc sử dụng là cột pha đảo. Hơn nữa, chất nhồi pha đảo sử dụng hệ dung mơi phân cực có tính kinh tế cao, phù hợp với điều kiện của phịng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này, đƣợc lựa chọn cột tách và tiền cột pha đảo C18.
Thông số cột tách và tiền cột: Cột tách: Zorbax C18 (150 mm × 4,6 mm × 5 àm); Tin ct: Zorbax SB C18 (5 mm ì 4,6 mm ì 5 àm); Nhit bung ct: 400C
3.1.1.2. Lựa chọn tốc độ dịng và dung mơi pha động
Dung môi pha động sử dụng hỗ hợp nƣớc cất khử ion và ACN với 5 mmol amoni axetat.
+ Tốc độ dòng pha động
Đối với thiết bị LC-MS/MS và các thông số cột tách là Zorbax C18 (150 mm × 4,6 mm × 5 µm) thƣờng sử dụng tốc độ dịng pha động từ 0,4-0,7 ml/phút.
Thực hiện phân tích hóa chất BVTV trên hệ thống sắc ký lỏng và khối phổ cùng điều kiện, chỉ thay đổi tốc độ dòng pha động thu đƣợc các píc cân đối đồng đều trong suốt q trình phân tích.
Bảng 3.1: Khảo sát tốc độ pha động phân tích các chất trên sắc ký lỏng khối phổ
STT Tốc độ dòng ml/phút Độ cân đối píc Diafenthiuron Độ cân đối píc Chlorothalonil 1 0,4 0,68 0,77 2 0,5 0,79 0,82 3 0,6 0,95 0,99 4 0,7 0,86 0,85 5 0,8 0,73 0,75
Dựa vào kết quả nhận đƣợc ở bảng 3.1 tốc độ dòng pha động 0,6 ml/phút là phù hợp để phân tích chlorothalonil và diafenthiuron, với tốc độ dịng này các píc của 2 chất nghiên cứu cân đối nhất.
+ Lựa chọn tỷ lệ pha động
Trong phƣơng pháp sắc kí lỏng khối phổ, pha động khơng chỉ ảnh hƣởng tới q trình tách các chất mà nó cịn ảnh hƣởng tới q trình ion hóa và tín hiệu của các chất phân tích. Với kỹ thuật ion hóa bằng dịng điện tử bắn phá các chất ở chế độ ion dƣơng, và ion âm, q trình ion hóa tăng khi có thêm các chất nhƣ axít axetic, axít focmic hoặc amoni axetat.
Hiện nay trên thế giới có xu hƣớng sử dụng hai chất để tăng thêm khả năng ion hóa là axít focmic và amoni axetat với nồng độ trong dung môi đều là 5 mmol. Với kinh nghiệm thực hiện phân tích nhiều loại hóa chất BVTV cho nhiều đối tƣợng nông sản chúng tôi sử dụng pha động hỗn hợp dung môi là nƣớc cất trao đổi ion và axetonitril. Để loại các píc nhiễu cơ chất của hai đối tƣợng nghiên cứu là rau cải và rau mùng tơi, chúng tơi sử dụng chƣơng trình gradient dung mơi nhƣ sau.
Bảng 3.2: Chương trình gradient dung mơi pha động
Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút)
Kênh A (ACN:H2O 1:9) 5 mmol amoni axetat
Kênh B (ACN:H2O 9:1) 5 mmol amoni axetat
0 0,6 70 30 1 0,6 70 30 1,5 0,6 0 100 7 0,6 0 100 7,5 0,6 70 30 10 0,6 70 30
Thực hiện chạy cùng điều kiện trên thiết bị chỉ thay đổi chất làm tăng khả năng ion hóa chúng tơi thu đƣợc kết quả nhƣ trong bảng:
Bảng 3.3: Khảo sát chất làm tăng hả năng ion hóa mẫu
Chất làm tăng khả năng ion hóa
Tốc độ dịng ml/phút Độ đáp ứng diện tích Diafenthiuron Signal to Noise (S/N) Diafenthiuron Amoni axetat 0,6 9638 260,86 Focmic axít 5487 188,82
Hình 3.1: Sắc ý đồ khảo sát chất làm tăng hả năng ion hóa
Dựa vào bảng kết quả chúng tôi thấy chất ammoni axetat có tác dụng làm tăng khả năng ion hóa tốt hơn so với chất focmic axít.
3.1.2. Khảo sát điều kiện khối phổ MS/MS
Để phân tích hóa chất BVTV bằng sắc ký lỏng khối phổ MS/MS cần phải xác định đƣợc ion phân tử (ion mẹ) và ion sản phẩm (ion con) của hóa chất BVTV. Với nguồn ion hóa ESI, chế độ ion dƣơng và ion âm các ion phân tử thƣờng đƣợc tạo thành bằng cách thêm một proton vào khối lƣợng phân tử của chất đó hoặc bớt đi một proton. Dựa vào khối lƣợng phân tử của các hóa chất BVTV, trên cơ sở tham khảo các nghiên cứu trƣớc đây trên thế giới, chúng tôi đã xác định đƣợc các ion phân tử của từng hóa chất BVTV (bảng 2.4).
Tuy nhiên, để định tính và định lƣợng cần phải xác định đƣợc ion sản phẩm của từng hóa chất BVTV. Sử dụng kim tiêm mẫu 20 µl tiêm trực tiếp các chất chuẩn hóa chất BVTV có nồng độ 100 ng/ml vào MS để xác định hai ion con ứng với từng
hiệu thấp hơn đƣợc dùng cho mục đích xác nhận (khẳng định). Các thơng số bắn phá nhƣ Dwell time (Chu kỳ quét), Fragmentor (Điện áp phân mảnh), và CE (năng lƣợng va chạm) đƣợc tối ƣu tự động theo thiết bị MS. Các kết quả đƣợc tổng hợp ở bảng 2.4.
ảng 3.4: Điều iện tối ưu cho thiết bị HPLC – MS/MS
HPLC MS/MS
Tỷ lệ kênh A: B = 70%: 30%
Chế độ ion hóa: ESI-posetive-Diafenthiuron Chế độ ion hóa: ESI-negative-Chlorothalonil Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút Chu kỳ quét: theo bảng 2.4
Áp suất đầu phun: 4000V Điện thế phân mảnh: theo bảng 2.4 Năng lƣợng va chạm: theo bảng 2.4
Các thơng số tối ƣu để phân tích chlorothalonil và diafenthiuron nhƣ sau: - Cột Zorbax C18 (150 mm ì 4,6 mm ì 5 àm)
- Tiền cột Zorbax SB C18 (5 mm ì 4,6 mm ì 5 àm) - Gradient pha động nhƣ bảng 3.2
- Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút
- Điều kiện khối phổ nhƣ trong bảng 2.3