nhưng mức tăng chậm. Nhiệt độ thủy phân thích hợp là 300C. pH thích hợp = 5,5. Chitin
ở dạng huyền phù với nồng độ tối ưu 0,75 – 1%. Đối với vấn đề phòng thối, do mẫu đối chứng không bị mùi hôi hay bị biến đổi do vi sinh vật sau 16 giờ thủy phân. Vì vậy khơng cần phịng thối cho các mẫu thủy phân.
Hiệu suất thủy phân chitin: Đánh giá hiệu suất thủy phân chitin của chitinase theo nồng
độ CPE, nhiệt độ, pH và nồng độ chitin, qua kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ CPE = 0,2 % là thích hợp cho q trình thủy phân chitin, hiệu suất thu được cao nhất (21,34%). Nhiệt độ thuỷ phân 300C cho hiệu suất cao nhất (20,89%). Môi trường có pH = 5,5 cho hiệu suất thuỷ phân cao nhất (19,78%). Khi nồng độ chitin là 1% cho hiệu suất cao nhất (22,15%). Mặc dù hiệu suất thuỷ phân chitin của chitinase thấp chỉ đạt 16,96 - 22,15%. So với thuỷ phân bằng cellulase, hemicellase, papain thương mại (hiệu suất rất cao 45 – 95%) nhưng giá trị của các sản phẩm thương mại này rất cao, phải nhập khẩu trong khi đó nguồn thu enzyme chitinase từ lá khoai lang rất dễ tìm, rẻ tiền và có quanh năm và cũng là một hướng tận dụng nguồn phế liệu lá khoai trong nông nghiệp.
IV. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT OLYGO-CHITIN OLYGO-CHITIN
Từ những kết quả nghiên cứu cho phép
đề xuất quy trình chiết rút chitinase và sử dụng chitinase thuỷ phân chitin thu olygo-chitin theo sơđồ sau:
Thuyết minh quy trình:
Lá khoai lang thu hái tươi, rửa bằng nước sạch để loại bỏ tạp chất. Xay nhỏ lá cùng với
đệm acetat pH = 5. Tỷ lệ đệm acetat/nguyên liệu = 1/1. Thời gian chiết 10 phút, chiết ở
nhiệt độ 5 – 100C. Sau khi chiết xong, lọc qua vải lọc để thu dịch chiết. Dịch chiết được ly tâm lạnh với tốc độ 9000 vòng/phút ở nhiệt độ
50C trong thời gian 15 phút. Thu dịch chiết chứa enzyme chitinase, loại bỏ bã ở đáy của
ống ly tâm. Kết tủa chitinase bằng ethanol nồng độ 65%, thời gian 45 phút thu được CPE
chitinase. Thuỷ phân chitin bằng CPE
chitinase với nồng độ 0,2%, nhiệt độ 300C, pH = 5,5 và nồng độ chitin 0,75 – 1%. Không phải bổ sung ethanol để phòng thối. Kết thúc thuỷ
phân, dịch thuỷ phân được lọc qua giấy lọc thu dịch có chứa olygo-chitin. Dịch đem cô đặc trong thiết bị cô chân không, được sấy khô thu sản phẩm olygo-chitin. V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 5.1. Kết luận Từ các kết quả nghiên cứu ở trên có thể rút ra một số kết luận như sau: * Chọn giống khoai thích hợp chiết rút chitinase. Giống khoai (giống 143) có thân màu xanh sẫm, lá to hình tim, dây dài phân nhánh ít. Là giống trồng để thu lá (lá to, cuống to và dài). S d ng lá khoai lang t i, b t n
thương (do tác động cơ học, do các loại sâu bệnh, do côn trùng ăn lá) sẽ thu enzyme chitinase có hoạt độ cao hơn.
* Các điều kiện thích hợp cho tách chiết chitinase DC, thu nhận CPE.
+ Dung môi chiết là đệm acetat pH=5. Tỷ
lệ dung môi/nguyên liệu 1/1, thời gian chiết 10 phút + Sử dụng ethanol kết tủa với nồng độ 65%, thời gian kết tủa 45 phút. + Nhiệt độ thích hợp của chitinase là 300C, độ bền nhiệt kém, pH thích hợp = 5,5 * Các điều kiện thích hợp cho thủy phân chitin.
+ Nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy là 300C, pH = 5,5, nồng độ CPE chitinase = 0,2%. Chitin sử dụng cho thuỷ phân ở dạng huyền phù với nồng độ thích hợp 0,75 – 1%.
+ Khơng cần sử dụng ethanol hay các chất khác để phòng thối cho quá trình thủy phân.
5.2 Đề xuất ý kiến
+ Nghiên cứu tinh sạch chitinase dịch chiết bằng các phương pháp phù hợp để thu chitinase có hoạt tính cao hơn.
+ Cần nghiên cứu một số dẫn xuất khác của chitin (swollen-chitin, glycol-chitin) làm cơ
chất thủy phân, qua đó có thể so sánh hiệu + Đệm acetat pH = 5 + Tỷ lệ dm/ng.liệu = 1/1 + Thời gian: 10 phút + Kết tủa bằng ethanol + Nồng độ ethanol: 65% + Thời gian: 45 phút +[CPE]: 0,2% +Nhiệt độ: 300C +pH = 5,5 +[Chitin]:0,75-1% Lá khoai lang Loại bã Loại bã
Xay nhỏ Chiết enzyme Lọc qua vải lọc Ly tâm Dịch chiết enzyme
quả thủy phân của chitinase với các dẫn xuất chitin khác nhau.
+ Cần tiếp tục nghiên cứu về chitinase ở
một số loài thực vật khác cũng như các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitinase
cao. Từ đó có những hiểu biết sâu hơn về
chitinase, so sánh đánh giá sâu hơn về tính chất, hiệu quả thủy phân chitin của chitinase từ các nguồn khác nhau.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Vũ Ngọc Bội (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân protein cá bằng enzym protease từ
B.sutilis.s 5, Luận án tiến sĩ sinh hóa học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh. 2. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Cao Cường (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học, tập 1, Nhà
xuất bản Đại học Quốc Gia, Tp Hồ Chí Minh.
3. Đỗ Văn Ninh (2004), Nghiên cứu quy trình thủy phân Protein bằng protease nội tạng cá, mực và thử nghiệm sản xuất sản phẩm mới từ Protein thực phẩm, Luận án Tiến sĩ, Đại học Thủy sản, Nha Trang.
4. Lê Ngọc Tú (Chủ biên), La Ăn Chứ, Đặng Thị Thu, Phạm Quốc Thăng, Nguyễn Thị Thịnh, Bùi
Đức Hợi, Lưu Duẩn, Lê Dỗn Biên,(2000), Hóa sinh học cơng nghiệp, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
5. Abeles, F.B., R.P. Bosshart, L.E. Forrence, and W.H. Habig. (1970), Preparation and purification of glucanase and chitinase from bean leaves. Plant Physiol. 47: 129_134.
6. Collinge, D.B., K.M. Kragh, J.D. Mikkelsen, K.K. Nielsen, U. Rasmussen, and K. Vad. (1993), Plant chitinases. Plant J. 3: 31_40.
7. Klaus-D. Spindler. (1997), Chitinase and chitosanase assays, Universitat Ulm, Germany.
8. Punja, Z.K. and Y.Y. Zhang. (1993), Plant chitinases and their roles in resistance to fungal disease. J. Nematol. 25: 526_540.
9. Wen-Chi Hou, Ying-Chou Chen and Yaw-Huei Lin.(1998), Chitinase activity of sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam var. Tainong 57), 39: 93-97, Institute of Botany, Academia Sinica,
Nankang, Taipei 115, Taiwan, Republic of China,Department of Bioengineering, Tatung Institute
BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM ENZYME CHITOSANASE KỸ
THUẬT TỪSTREPTOMYCES GRISEUS
INITIAL RESEARCH ON OBTAINING CHITOSANASE FROM STREPTOMYCES GRISEUS
Phạm Hồng Ngọc Thùy Khoa Chế biến - Trường Đại học Nha Trang
Tóm tắt
Streptomyces griseus VTCC-A-1126 có khả năng sinh tổng hợp chitosanase khi chúng được nuôi trong môi trường có chất cảm ứng là chitosan. Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được ni cấy để trong mơi trường có chất cảm ứng là chitosan. Streptomyces griseus VTCC-A-1126 được nuôi cấy để
sản xuất chitosanase theo phương pháp nuôi cấy lỏng. Sau khi dừng q trình ni, tiến hành ly tâm loại bỏ tế bào để thu dịch thể chứa chitosanase và dùng acetone để kết tủa thu chế phẩm enzyme loại bỏ tế bào để thu dịch thể chứa chitosanase và dùng acetone để kết tủa thu chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật. Chế phẩm enzyme (CPE) chitosanase này có pH thích hợp từ 4,5-5,0; nhiệt độ
thích hợp từ 40-45oC và có khả năng thủy phân dung dịch chitosan rất mạnh. Cụ thể, sau 24 giờ
thủy phân dung dịch chitosan 1% (tỷ lệ 0,4g CPE/100 ml dung dịch chitosan 1%) thì độ nhớt của dung dịch chitosan giảm 99,17% và hiệu suất của quá trình thủy phân đến glucosamine là 94,14%. dung dịch chitosan giảm 99,17% và hiệu suất của quá trình thủy phân đến glucosamine là 94,14%.
Từ khóa: Streptomyces griseus, chitosanase, chitosan, glucosamine
Abstract
Streptomyces griseus VTCC-A-1126 can synthesise chitosanase when grown on cultural environment contained inductive substance (chitosan). Streptomyces griseus VTCC-A-1126 was environment contained inductive substance (chitosan). Streptomyces griseus VTCC-A-1126 was incubated to create chitosanase by liquid culturing method. After cultivation, cells were discarded by centrifugation to obtain the culture filtrate containing chitosanase. After that acetone was added to this culture filtrate to collect chitosanase. The optimal pH of the chitosanase from Streptomyces griseus VTCC-A-1126 is 4.0 - 5.0 and its optimal temperature is 40 - 45oC. This enzyme can hydrolyse chitosan solution very well. Specifically, after 24-hour hydrolysing process, the viscosity of 1% chitosan solution decreased 99.17% (0.4g chitosanase/100 ml 1% chitosan solution) and the output of hydrolysing process into glucosamine is 94.14%.
.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Chitin, chitosan là polymer hữu cơ phổ biến trong thiên nhiên; trong động vật thủy sản đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, hàm lượng chitin chiếm tỷ lệ khá cao, từ 14-35% so với trọng lượng chất khô. Hiện nay chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như trong nông nghiệp, công nghiệp dệt, công nghiệp giấy, công nghiệp thực phẩm, mỹ phẩm, y - dược,...Do đó, việc nghiên cứu sản xuất chitin, chitosan và các dẫn xuất của chúng đang là vấn đề được quan tâm nghiên cứu. COS (Chitin/Chitosan - Olygosaccharide) là sản
phẩm thủy phân của chitin, chitosan; chúng là những chất có hoạt tính sinh học cao như chúng có tác dụng điều hòa lượng cholesterol, điều hòa áp suất trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, thúc đẩy quá trình bài tiết axit uric, chống ung thư, trị được bệnh viêm loét dạ dày, chuột rút và có khả năng làm tăng sức đề kháng cho cây trồng. COS có thểđược sản xuất bằng phương pháp hóa học (thủy phân chitin, chitosan bằng axit HCl đậm đặc) hoặc bằng phương pháp sinh học (dùng các enzyme như papain, hemicellulase, cellulase để thủy phân chitin, chitosan). Việc thủy phân chitin, chitosan bằng axit đậm đặc có nhiều
nhược điểm như chi phí tốn kém, hiệu suất thấp, gây ô nhiễm môi trường, hao mịn máy móc thiết bị và sản phẩm có hoạt tính khơng cao. Do đó, việc nghiên cứu sản xuất COS bằng phương pháp sinh học là một hướng đi có nhiều triển vọng vì điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, ít gây ơ nhiễm mơi trường và sản phẩm có chất lượng tốt. Vì vậy trong bài báo này, tơi xin trình bày kết quả nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật từ Strep. griseus VTCC-A-1126, từ enzyme này có thể được sử dụng để sản xuất COS bằng phương pháp sinh học.
II. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng nghiên cứu
Strep. griseus VTCC-A-1126 được lấy từ phòng bảo tồn giống vi sinh vật thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội ở dạng đông khô, được chuyển về Nha Trang bằng máy bay và được bảo quản ở 4oC.
2. Vật liệu nghiên cứu
Chitosan (độ deacetyl 95%, độ ẩm 12%, hàm lượng chất không tan 0,18%, hàm lượng Ca2+ 0,01%, hàm lượng nitơ tổng số 8,42%, độ tan trong acid acetic 1,5% là 99,82%; được lấy từ Trung tâm Chế biến, Trường Đại học Nha Trang).
Các hóa chất: albumin, yeast extract, peptone, starch soluble (tinh bột hòa tan), D- mannitol, glucose, saccharose, p- dimethylaminobenzaldehyde, glucosamine hydrochloride, kali natri tartrat, natri wonframat, natri molypdat, và một số hóa chất khác.
3. Phương pháp nghiên cứu
Cách tiến hành thí nghiệm: Chủng Strep. griseus VTCC-A-1126 → nuôi cấy → ly tâm thu tế bào → nuôi sinh enzyme chitosanase → ly tâm → dịch chứa enzyme chitosanase → kết tủa → CPE chitosanase kỹ thuật.
Môi trường nuôi cấy Strep. griseus VTCC- A-1126 gồm: Peptone: 2%; Yeast extract: 1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; Nguồn cacbon: khảo sát 4 nguồn cacbon khác nhau (Saccharose :2%, Glucose: 2%, Mannitol: 2%, Tinh bột thơ hịa tan: 2%).
Môi trường nuôi sinh enzyme chitosanase gồm: Peptone: 1%; KCl: 0,05%; K2HPO4: 0,1%; MgSO4.7H2O: 0,05%; FeSO4: 0,001%; nồng độ chất cảm ứng (chitosan) thay đổi lần lượt là 0,5%; 1,0%; 1,5%; 2,0%. Xác định hoạt tính của enzyme chitosanase [3]: hoạt tính của enzyme chitosanase được xác định dựa trên phương pháp định lượng sản phẩm glucosamin của quá trình phân giải chitosan. Một đơn vị hoạt tính được xác định là lượng enzyme cần thiết để giải phóng ra 1µg glucosamin trong thời gian một phút ở nhiệt độ 30oC.
Xác định hàm lượng đường glucosamin theo Elson-Morgan [3]
Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry [3]
Xác định số lượng tế bào theo phương pháp đếm khuẩn lạc [1], [2]
Độ nhớt được xác định bằng nhớt kế rotor.