Các thí nghiệm chuyển gen đƣợc tiến hành theo tiến trình nhƣ đã nêu, đến giai đoạn ra cây thu đƣợc 39 cây từ giống ĐT 22, 7 cây từ giống DT 2008, 10 cây từ giống DT 84 sống sót. Sau khi tách DNA tổng số (hình 3.4) của các mẫu lá, phân tích PCR kiểm tra sự có mặt của các gen cry1B, hpt ở các dòng đậu tƣơng thế hệ To, thấy đƣợc: 7 cây của DT 2008 không có biểu hiện gen hpt và cry1B, trong 10 cây DT 84 có 1 cây dƣơng tính với cry1B và 1 cây dƣơng tính với cả hai gen cry1B và hpt, ĐT 22 thu đƣợc số cây dƣơng tính với gen chuyển nhiều nhất, trong đó có 7 cây dƣơng tính với gen
cry1B, 5 cây dƣơng tính với gen hpt, 9 cây dƣơng tính với cả hai gen cry1B và hpt, 18 cây âm tính. Hiệu quả biến nạp gen cry1B ở đậu tƣơng ĐT 22 cao nhất trong số 3 giống nghiên cứu (ĐT 22, DT2008, DT84) đạt 0,42 %.
Nhƣ vậy, với kết quả nhƣ trên, có thể nói quy trình và phƣơng pháp chuyển gen kháng sâu cry1B ở giống đậu tƣơng ĐT22 đã đƣợc đánh giá và tối ƣu hóa phần nào cải thiện đƣợc hiệu quả biến nạp gen.
Hinh 3.5: Kết quả điện di DNA tổng số các cây To
Ghi chú:
1-3: DNA tổng số từ mẫu lá của các dòng ĐT 22 4-6: DNA tổng số từ mẫu lá của các dòng DT 2008 7-10: DNA tổng số từ mẫu lá của các dòng DT 84
Bảng 3.10:Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tƣơng chuyển gen với cặp mồi
cry1B Tên giống Số lƣợng hạt giống (hạt) Số mẫu ban đầu (mẫu) Số cây sống sót (cây) PCR (+) (cây)
Hiệu suất biến nạp gen cry1B (%) Cry1B hpt ĐT22 50 100 39 16 17 0,41 DT2008 50 100 7 0 0 0,00 DT84 50 100 10 1 1 0,10
Các dòng cây To đƣợc ký hiệu để thuận tiện theo dõi nhƣ sau:
Các dòng của giống ĐT22: C22.1 đến C22.39 (C22.1 – C22.18 là các dòng không mang gen chuyển, C22.19 – C22.38 là các dòng mang gen kháng sâu cry1B, C22.19 – C22.39 là các dòng mang gen hpt)
Các dòng của giống DT 2008: C08.1 đến C08.7, các dòng của giống ĐT 84: C84.1 đến C84.10, không có cây nào dƣơng tính với gen chuyển.
Các dòng của giống DT 84: C84.1 đến C84.10 (C84.1 dƣơng tính với cả hai gen cry1B và hpt, còn lại là các dòng không mang gen chuyển)
Hình 3.6: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen hpt ở các dòng của giống đậu tƣơng ĐT 22 thế hệ T0
Ghi chú: M: Maker ( kích thước 1kb) 1: Đối chứng (+) (kích thước 556 bp) 2: Đối chứng (-): H2O 3: Dòng đậu tương C22.27 4: Dòng đậu tương C22. 1 5: Dòng đậu tương C22. 5 6: Dòng đậu tương C22.15 7: Dòng đậu tương C22. 31 556 bp
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen cry1B ở các dòng của giống đậu tƣơng ĐT 22 thế hệ T0 Ghi chú: M: Maker ( kích thước 1kb) 1: Đối chứng (+) (kích thước 642 bp) 2: Dòng đậu tương C22.31 3: Dòng đậu tương C22. 15 4: Dòng đậu tương C22. 39 5: Đối chứng (-): H2O
Hình 3.8: Một số hình ảnh ra cây, thu hoạch quả của các dòng đậu tƣơng ĐT 22 thế hệ T0
2.5.2. Đánh giá khả năng phân ly của gen kháng sâu cry1B và gen chọn lọc hpt
(kháng kháng sinh) ở dòng đậu tƣơng chuyển gen
Vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos là một vector nhị thể mang 2 T-DNA, gen kháng sâu và gen kháng kháng sinh nằm trên hai T-DNA, nên có khả năng các gen sẽ phân ly ở thế hệ cây T1 và nhƣ vậy, có thể đánh giá cây trồng chuyển gen trên phƣơng diện an toàn sinh học.
Trong thí nghiệm của chúng tôi, các dòng đậu tƣơng T0 giống ĐT22 duy trì đƣợc đến khi thu hoạch là 15 dòng, 2 dòng của giống DT2008, không có dòng DT 84 nào sống sót. Số lƣợng hạt thu đƣợc của các dòng đậu tƣơng thế hệ T0 tối đa là 23 hạt của dòng C22.7 và số lƣợng hạt tối thiểu là 3 hạt của dòng C22.33.
Để xác định sự có mặt của gen kháng sâu (cry1B) và gen kháng kháng sinh hygromycine (hpt) ở giống ĐT 22 trong thế hệ sau, chúng tôi tiến hành gieo trồng hạt T1 của các dòng T0 dƣơng tính với cả hai gen cry1B và gen hpt (C22.19 đến C22.38), mỗi dòng 1 hạt. Lá chét thứ 2 của các cây T1 sẽ đƣợc sử dụng để tách DNA và kiểm tra sự phân ly của gen kháng sâu và gen kháng kháng sinh thông qua PCR. Kết quả thu đƣợc thông kê ở bảng 3.11, cho thấy:
Ở thế hệ T1, đã xuất hiện các cây mang chỉ mang gen kháng sâu cry1B (chiếm tỉ lệ 3/18 = 16,7%), thuộc các dòng C22.26.1, C22.30.1 và C22.31.1.
Bảng 3.11: Xác định sự có mặt của gen cry1B và gen kháng kháng sinh hpt
thế hệ T1 thông qua PCR Dòng Cry1B hpt C22.19.1 + + C22.20.1 + + C22.21.1 + C22.22.1 + + C22.23.1 + + C22.24.1 + C22.25.1 + + C22.26.1 + C22.27.1 + + C22.28.1 + C22.29.1 + + C22.30.1 + C22.31.1 + C22.32.1 + C22.33.1 + + C22.34.1 + + C22.35.1 + C22.36.1 + +
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR gen cry1B ở các dòng của giống đậu tƣơng ĐT 22 thế hệ T1 Ghi chú: M: Maker ( kích thước 1kb) 1: Đối chứng (-): H2O 2: Đối chứng (+) (kích thước 642 bp) 3: Dòng đậu tương C22.31.2 4: Dòng C22. 26.1 5: Dòng C22. 28.1 6: Dòng C22. 36.1 7: Dòng C22.33.1 8: Dòng C22 34.1 9: Dòng C22.33.1 10: Dòng C22.39.1 11: Dòng đậu tương C22. 30.1
Cho đến thời điểm hiện tại, đã có nhiều công bố sử dụng vector 2T –DNA để biến nạp gen đích vào đối tƣợng quan tâm. Năm 2003, Breitler J.C. và cộng sự đã sử dụng vector pX2 [22] cải tiến và biến nạp vào lúa. Kết quả phân tích cho thấy ở thế hệ cây chuyển gen ban đầu (T0) có tới 82-90% cá thể mang gen quan tâm (gen bar) và gen kháng kháng sinh hygromycin đƣợc chuyển đồng thời vào cây. Tuy nhiên, ở thế hệ T1, tỷ lệ cây kháng thuốc diệt cỏ và hygromycin chỉ chiếm 14,3 và 17%. Phân tích các tính trạng hình thái của cây T0 cho thấy, gen chọn lọc hygromycin và gen kháng chất diệt cỏ nằm ở các vị trí không liên kết trên cùng locus nên bị phân tách ở thế hệ T1. Bằng phƣơng pháp này cây lúa chuyển gen không mang gen kháng kháng sinh đã đƣợc tạo ra.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN
Từ các kết quả thu đƣợc chúng tôi đƣa ra một số kết luận sau:
1. Trong 3 giống khảo sát (ĐT 22, DT84, DT 2008, ), giống đậu tƣơng ĐT 22 cho hệ số nhân chồi cao (số chồi trung bình/mẫu = 4), chiếm 84,78%, khả năng kéo dài chồi, ra rễ và sức sống khi ra cây tốt.
2. Chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen ở đậu tƣơng ĐT 22 là EHA105. 3. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển gen đậu tƣơng ĐT22 đƣợc tối ƣu
hóa nhƣ sau:
Nồng độ vi khuẩn (OD600) : 0,5-0,7
Gây tổn thƣơng trong dung dịch nuôi khuẩn cho hiệu quả chuyển gen cao nhất Thời gian lây nhiễm tối ƣu: 1h
Nồng độ AS 200mg/l làm tăng hiệu quả biến nạp gen Thời gian đồng nuôi cấy 5 ngày, ở 240C trong tối
Nồng độ hygromycin 20mg/l có hiệu quả chọn lọc các dòng chuyển gen. 4. Hiệu quả biến nạp gen thông qua chủng vi khuẩn EHA105 mang vector pX2 –
C1mpi:cry1B:nos vào giống đậu tƣơng ĐT22, đƣợc kiểm tra bằng PCR gen kháng sâu cry1B là 0,41%.
5. Đã thu đƣợc cây T1 chỉ mang gen cry1B qua kiểm tra PCR.
2. ĐỀ NGHỊ
1. DT2008 và DT84 là hai giống tiềm năng, cần đƣợc nghiên cứu hoàn thiện quy trình tái sinh cây hoàn chỉnh và chuyển gen để tạo dòng đậu tƣơng ƣu tú vừa có khả năng chịu hạn tốt vừa có khả năng kháng sâu.
2. Tiến hành đánh giá sự có mặt của gen kháng sâu Cry1B và gen kháng kháng sinh hygromycin (hpt) của các thế hệ cây chuyển gen giống ĐT22 thông qua Southern blot nhằm tăng mức độ chính xác của số liệu nghiên cứu.
3. Tiến hành thí nghiệm với sâu hại đậu tƣơng để có thể đánh giá xác thực khả năng kháng sâu của các dòng đậu tƣơng mang gen cry1B thu đƣợc, cũng nhƣ biểu hiện của promoter cảm ứng C1mpi về mặt hình thái.
4. Tiến hành các thí nghiệm tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chuyển gen khác để nâng cao hơn nữa hiệu quả biến nạp gen, các yếu tố nhƣ: nồng độ L-cystein, DTT, Natri thiosunfat.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Đặng Thị Dung (1999), Côn trùng ký sinh và mối quan hệ của chúng với sâu hại chính trên đậu tương vùng Hà Nội và phụ cận, Tóm tắt luận án TS, Hà Nội. 2. Lƣơng Minh Khôi, Phạm Thị Vƣợng (1989), Một số kết quả nghiên cứu sâu hại
đậu tương và biện pháp phòng trừ, Kết quả nghiên cứu BVTV 1979-1989, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.59-67.
3. Nhà xuất bản thống kê Hà Nội, 2009. Niên Giám Thống Kê, 2008. 4. Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị
Đào(1999), Cây đậu tương, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Chung, Đặng Trọng Lƣơng, Trƣơng Thị Thanh Mai (2005), Kết quả nghiên cứu ban đầu về khả năng tái sinh của giống đậu tương phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen, Tạp chí Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, số 20, tr.35-38.
6. Trần Đình Chiến (2002), Nghiên cứu côn trùng, nhện lớn bắt mồi sâu hại đậu tương vùng Hà Nội và phụ cận; đặc tính sinh học của bọ chân chạy Chlaenius bioculatus Chaudoir và bọ rùa Menochilus sexmaculatus Fabr, Tóm tắt luận án TS, Hà Nội
7. Trần Đình Long (2001), Cây đậu tương, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 8. Viện Bảo vệ thực vật (1976), Kết quả điều tra côn trùng 1967-1968, Nxb Nông
thôn, Hà Nội, tr.451-455.
Tài liệu tiếng Anh
9. Adamczyk J.J., Adams L.C., Hardee D.D., (2001),“Field efficacy and seasonal profiles for terminal leaves of single and double Bacillus thuringiensis toxin cotton genotypes”, J Econ Entomol 94, p.1589-1593.
10.Annette Droste, Giancarlo Pasquali and Maria Helena Bodanese-Zanettini (2000), “ Intergrated Bombardment and Agrobacterium Transformation System: an Alternative Method for Soybean Transformation”, Plant molecular Biology Reporter, 18, p.51 – 59. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
11.Arumin A. (1978), Pests of soybean and their control in Thailand. Pests of grain legumes. Acad. Press, London, New York, San Fransisco, p.43-46.
12.Aswath C.M., Mo S.Y., Kim D.H. and Park S.W., (2005), “Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic marker phosphomannoes isomerase”, Plant Cell Rep. 24, p.426-432.
13.Brian J. Martinell and others ( 2006), Soybean transformation method, Monsanto LLC, US.
14.Boethel D.J., (1999), Assessment of soybean germplasm for multipleinsect resistance. In: Clement SL, Quisenbury SS (eds) Global plant genetic resources for insect resistant crops. CRC, Boca Raton, p.101-129.
15.Boscariol R.L., Almeida W.A., Derbyshire M.T., Mourao-Filho F.A. and Mendes B.M. (2003). The use of PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orangeplants (Citrus sinensis L. Osbeck)”, Plant Cell Rep., 22, p.122-128. 16.Clemente T., LaVallee B.J., Howe A.R., Ward D.C., Rozman R.J., Hunter P.E.,
Broyles D.L., Kasten D.S., Hinchee M.A. (2000), “Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacterium-mediated transformation”, Crop Sci. 40, p.797-803.
17.David A. Somers, Deborah A. Samac and Paula M. Olhoft (2003), “ Recent Advances in Legume Transformation”, Plant Physilogy, 131, p.892 - 899. 18.Daley K., Knauf V.C., Summerfelt K.R. and Turner J.C. (1998), “Co-
transformation with one Agrobacterium tumefaciens train containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants”, Plant Cell Reports, 17, p.489-496.
19.De Block M. and Debrouwer D. (1991), “Two T-DNA‟s co-transformation into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infectionare mainly integrated at the same locus”, Theor. Appl. Genet. 82, p.257-263.
20.Di R., Purcell V., Colin G.B., Ghabrial S.A., (1996),” A production of transgenic soybean line expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene”,
Plant Cell Rep. ,7, p.399-402.
21.Dufourmantel N., Tissot G., Goutorbe F., Garcon F., Muhr C., Jansens S., Pelissier B., Peltie G., Dubald M. (2005), “Generation and analysis of soybean plastid transformants expressing Bacillus thuringiensis Cry 1Ab protoxin”, Plant Mol. Biol. 58, p.659-668.
22.Estruch J.J., Warren G.W., Mullins M.A., Nye G.J., Craig J.A., Koziel M.G., (1996), “Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with awide spectrum of activities against lepidopteran insects”, Proc Natl Acad Sci., 93, p. 5338-5394.
23.Gianessi L.P., Silvers C.S., Sankula S., Carpenter J.E., (2002). Plant biotechnology: current and potenyial impact for improving pest management in US agriculture and analysis of 40 case studies. Pp 1-12. website:www.ncfap.org. 24.Hinchee M., Connor-Ward D.V., Newell C.A., McDonnell R.E., Sato S.J., Gasser
transgenic soybean plant using Agrobacterium-mediated DNA transfer”,
Bio/Technology, 6, p.915-922.
25.Hai Ping Hong, Hongyi Zhang, Paula Olhoft, Steve Hill, Hunt Wiley, Effie Toren, Helke Hillebrand, Todd Jones, and Ming Cheng (2007), “ Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium
in soybean (Glycine max( L.) Merr.)”, In Vitro Cellular and Development Biology – Plant, 43(6), p.558 – 568.
26.Hinson K., E.E. Hartwig (1982), Soybean production in the tropics. FAO, Rome, p.66-71.
27.Hoa T.T.C. and Bong B.B. (2003), “Efficient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa L) using mannose selection system”,
Vietnam Journal of Agroculture & Rual Development, 1+2, p.60-63-18.
28.Hoa T.T.C., AlBabili S., Schaub P., “Potrykus I. and Beyer P. (2003). Gol den indica japonica rice lines amemable to registration”, Plant Physiology. 133, p.161-169.
29.ISAAA (2009), ISAAA Celebrates the Life of its Founding Patron, Nobel Peace Laureate Dr. Norman E. Borlaug (1914-2009), ISAAA Brochure available at: http://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/tribute/borlaug/ISAAA-Tribute.pdf 30.James C. (2008), Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007.
ISAAA Brief No. 38. ISAAA: Ithaca, NY.
31.James C. (2009), Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2008. ISAAA Brief No. 39. ISAAA: Ithaca, NY.
32.Joersbo M., Peterson S.G. and Okkels F.T., (1999), “Parameter interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet”,
Physiol. Plant, 105, p.109-134.
33.Kobayashi T. (1972), “Insect pests of soybean and their control”, Res.Quart. 6(4), p.212-218.
34.Kobayashi T. (1976), “Insect pests of soybean in Japan and their control”, Pest Articles and News Summaries (UK), 22(3), p.336-349.
35.Koziel M.G., Beland G.L., Bowman C., Carozzi N.B., Crenshaw R., Crossland L., Dawson J., Desai N., Hill M., Kadwell S., Launis K., Lewis K. (1993), ”Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from bacillus thuringiensis”, Biotechnology, 11, p.194-200. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
36.Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N. and Kumashiro T. (1996), “Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection marker”, The Plant J., 10(1), p.165-174.
37.Ko T.S. & Korban S.S., (2004), “Enhancing the frequency of somatic embtyonenesis following Agrobacterium-mediated transformation of mimmature cotylendons of soybean (Glycine max L. Merrill)”, In vitro Cell. Dev. Biol-plant, 40, p.552-558.
38.Lawton K. (1999), Roundup of a market farm industry News, February, p 4-8. 39.Lee M.K., Walter F.S., Hart H., Palekar N., Chen J.S. (2003), “The mode of
action of the Bacillus thuringiensis protein Vip3A differs from that of Cry1Ab delta-endotoxin”, Appl & Envir Micro, 69, p.4648-4657.
40.L.L. Loguercio, M.L. Barreto , T.L. Rocha , C.G. Santos , F.F. Teixeira and E. Paiva (2002), “Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip -derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm”, Journal of Applied Microbiology, 93(2), p.269 – 277.
41.Martinell B.J., Julson L.S., Emler C.A., Yong H., McCabe D.E., Williams E.J., inventors Map 7 (2002) Soybean Agrobacterium transformation method. US. Patent Application No. 6384301.
42.Maqbool S.B., Riazuddin S., Loc N.T., Gatehouse A.M.R., Gatehouse J.A., Christou P. (2001), “Expression of multiple insecticidal genes confers broad resistance against a range of diffirent rice pests”, Mol Breed, 7, p.85-93.
43.McCabe D.E., Swain W.F., Martinell B.J., “Christou P. (1998). Factors effecting soybean cotylendonary node transformation”, Bio/Technology, 6, p.923-926. 44.Miles JS and Guest JR (1984), “Nucleotide sequence and transcriptional start
point of the phosphomannose isomerase gene (manA) of Escherichia coli”, Gene, 32(1-2), p. 41-8.
45.Naito A., I.A. Harnoto, I. Hatori (1983), Podborer Etiella hobani (Butler) of soybean in Indonesia, Central Res. Inst. for Food Crops, Indonesia.
46.Olhoft P.M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N.C., Somers D.A. (2001), “The role of thiol comppounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotylendonary node cells”, Plant Cell Rep., 20, p.731-737.
47.Olhoft P.M., Somers D.A. (2001), “L-Cysteine increases Agrobacterium- mediated T-DNA delivery into soybean cotylendonary node cells”, Plant Cell Rep, 20, p.706-711.
48.Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A. (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycine B selection in the cotylendonary node method”, Plant, 216, p.723-735.
49.Ooi P.A.C. (1973), Some insect pests of green gram Phaseolus aureus. Malaysian Agricultural Journal, 49, p.131-142.
50.Owen M.D.K. (1999). Current use of transgenic herbicide-resistant soybean and corn in the USA, p. 1-6.
51.Parrott W.A., Adang M.J., Bailey M.A., All J.N., Boerma H.R. and Stewart N.S.