Với tất cả các mẫu polysaccharide nhận được khi chiết từ rong có xử lý kiềm, hàm lượng agarose đều tăng lên rõ rệt (hình 3.8.), điều này chứng tỏ rằng trong các mẫu polysaccharide chiết từ rong tự nhiên đều có chứa hàm lượng disaccharide porphyran nhất định và hàm lượng porphyran này thay đổi và sự thay đổi đó phụ thuộc vào polysaccharide chiết từ loài rong khác nhau.
Xử lý kiềm trong quá trình chiết agar ở nhiệt độ 80oC nhằm loại bỏ gốc sulfate không bền ở vị trí G6 trong phân tử agar làm tăng chất lượng của agar. Từ kết quả thu được từ bảng 3.3. cho thấy agar chiết từ rong có xử lý kiềm vẫn còn một lượng nhỏ sulfate (từ 0,45% đến 0,7%) chứng tỏ rằng nhóm sulfate trong phân tử agar không chỉ ở vị trí C6 axial không bền trong
monome (porphyran) mà còn ở vị trí C2, C4 equatorial bền vững của monome galactose và các nhóm sulfate ở vị trí bền này không bị tách khi bị xử lý kiềm.
Hiệu suất chiết Agarose % 90 78.9 80 70 69.1 60 50 40 32.1 35.6 30 20 10 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
Chiết tự nhiên Chiết có xử lý kiềm
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết agarose theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria
Salicornia
Như vậy dựa vào kết quả phân tích thành phần và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đưa ra nhận xét sơ bộ như sau:
- Phân đoạn agar chiết từ rong tự nhiên ngoài hai thành phần chính là galactose và 3,6-anhydrogalactose, còn có mặt của porphyran (agaropectin)
- Kết quả phân tích nhận được khẳng định sự có mặt của agarobiose và agaran trong polysaccharide chiết từ rong agarophite đúng như cấu trúc của agar đã được dự đoán
- Phân đoạn polysaccharide chiết tự nhiên (xử lý cồn) và có xử lý kiềm ở nhiệt độ khoảng 80oC có hàm lượng sulfate thấp và hàm lượng LA cao. Vậy, loại polysaccharide này là dạng agar có cấu trúc của chúng sẽ là agarose bị methyl hóa và sulfate hóa ở mức độ khác nhau tùy theo bản chất của loài rong. Và, agar này có khả năng tạo gel.
Để xác định tính chất gel của agar trong mỗi mẫu polysaccharide, chúng tôi xác định ba thông số quan trọng sau:
- Sức đông (g/cm2) - Nhiệt độ đông (oC) - Nhiệt độ tan đông (oC)
Kết quả được thể hiện trên bảng 3.4. như sau:
Bảng 3.4. Bảng thông số thể hiện khả năng tạo gel của hai loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Thông số Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
Chiết tự Chiết xử lý Chiết tự Chiết xử nhiên (xử lý kiềm nhiên (xử lý lý kiềm
cồn) cồn)
Sức đông (g/cm2) 98,7 380,5 120,5 520
Nhiệt độ đông (oC) 40,1 41,2 39,7 41,2
Nhiệt độ tan đông (oC) 79,6 90,1 89,5 87,8
Sức đông 2 g/cm 600 520 500 400 380.5 300 200 98.7 120.5 100 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
Chiết tự nhiênChiết có xử lý kiềm
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh sức đông của agar chiết theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria
Cũng như agar được chiết bằng phương pháp chiết tự nhiên (xử lý cồn) từ các loài Gracilaria ở các vùng trên thế giới như Mexico, Nam Mỹ, ... [41], [42], tương tự với các nước trong cùng khu vực châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Philippines..., agar chiết tự nhiên (xử lý cồn) từ loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia tại Việt Nam có sức đông thấp (dưới 100 g/cm2).Sức đông của Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia chiết tự nhiên (xử lý cồn) chỉ đạt khoảng 98,7 g/cm2 và 120,5 g/cm2. Thông qua biểu đồ hình 3.9, sức đông của agar có xử lý kiềm tăng lên đáng kể so với chiết tự nhiên (xử lý cồn) (khoảng 4 lần). Cụ thể, đối với rong
Gracilaria Heteroclada, sức đông tăng từ 98,7 g/cm2 đến 380,5 g/cm2, và rong Gracilaria Salicornia, sức đông tăng từ 120,5 g/cm2 lên 520 g/cm2.
Để ứng dụng agar trong công nghệ thực phẩm thì sức đông của agar phải trên 300 g/cm2, chính vì vậy, nhất thiết phải sử dụng phương pháp xử lý kiềm vì trong môi trường kiềm đã xảy ra phản ứng đóng vòng 3,6-anhydro từ porphyran (là tiền thân của agarobiose) và loại bỏ nhóm sulfate (vốn có nhiều trong agar tự nhiên thuộc chi Gracilaria) để tạo ra disaccharide agarbiose. Sự thay thế này đã làm thay đổi cấu trúc trong toàn bộ phân tử agar và hình thành mạng lưới gel ba chiều dẫn đến làm tăng sức đông gel agar [1], [37]. Nhờ có phương pháp chiết có xử lý kiềm, sức đông của agar sẽ tăng lên đáng kể, mang lại hiệu quả cao trong việc sử dụng agar, tăng chất lượng của agar thành phẩm.
Kết luận: Đối với 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
- Đã chiết (tự nhiên và có xử lý kiềm) được mẫu polysaccharide có hàm lượng từ 19% đến 29%.
- Mẫu polysaccharide có thành phần chính là: D-galactose (G), 3,6-L- anhydrogalactose (A) và sulfate.
- Đã xác định được tính chất gel của agar với 03 thông số: sức đông, nhiệt độ đông và nhiệt độ tan đông.
3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ 02 LOÀIRONG GRACILARIA SALICORNIA VÀ GRACILARIA HETEROCLADA RONG GRACILARIA SALICORNIA VÀ GRACILARIA HETEROCLADA
Mục đích của việc phân tích thành phần hóa học của mẫu polysaccharide thu được từ quá trình phân lập nhằm xác minh cấu trúc của sản phẩm thu được từ rong như thế nào. Để làm rõ cấu trúc hóa học của sản phẩm, chúng tôi sử dụng các phương pháp vật lý để phân tích cấu trúc bao gồm các phương pháp phân tích kết hợp của các phổ:IR, 13C NMR, 1H NMR, COSY, HMBC, HSQC.
3.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phương pháp IR là phương pháp đơn giản, thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vân phổ dao động tương ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử.
Trong phân tích cấu trúc polysaccharide, phương pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí các nhóm sulfate, các liên kết glycoside tồn tại trong agar, để từ đó nhận biết cấu trúc đặc trưng của chúng. Theo thống kê, ta có một số dao động sóng đặc trưng như bảng 3.5.
Bảng 3.5. Một số dao động đặc trưng của các nhóm nguyên tử và các liên kết trong agar [18], [43], [44], [45]
Loại dao động Số sóng Cường độ
(cm-1) IR Raman Dao động biến dạng của liên kết C-H trong 1460- Yếu Mạnh
nhóm CH3 1470
Dao động hóa trị phản đối xứng ( as) của 1270- Yếu Mạnh
nhóm O=S=O 1200
Dao động hóa trị đối xứng ( s) của nhóm 1370 Tr.bình Mạnh O=S=O
Dao động của liên kết C-O-C ( Liên kết 1067 Mạnh Mạnh glycoside)
Dao động của liên kết C-O-C (3,6- 930 Mạnh Tr.bình anhydrogalactoza)
Dao động biến dạng của liên kết C-H của 890 Mạnh nguyên tử C trong gốc -monome.
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C4 trong 845 Yếu Mạnh D-gal
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C2 trong 830 Yếu Mạnh D-gal
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C6 trong 820 Yếu Mạnh D-gal
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C2 trong 800-805 Yếu Mạnh L-Angal
Dao động khung của vòng galactopyrannoza 770 Yếu Mạnh Dao động biến dạng của liên kết (1-3) C-O-C 734 Yếu Mạnh Dao động biến dạng của liên kết (1-4) C-O-C 719 Yếu Yếu
Phổ IR của rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia được trình bày trên hình 3.10. và hình 3.11.
%T 99 98 96 94 92 2149.20cm-1 772.75cm-1 90 88 890.64cm-1 86 931.10cm-1 84 967.96 82 1186.41 1658.08cm -1 1422.33 1042.23 80 1377.13cm-1 3595.96cm -1 2898.94cm -1 78 2947.09 1078.61cm-1 3189.50cm-1 76 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500400 4000 cm-1
Hình 3.11. Phổ IR của agar từ Gracilaria Salicornia
Giải hấp thụ ứng với tần số dao động hóa trị của liên kết C-H no là 2900cm-1 [46]. Trên phổ hồng ngoại của các mẫu agar nghiên cứu từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia (hình 3.10. và hình 3.11.) có xuất hiện giải hấp thụ ở tần số này, cụ thể Gracilaria Salicornia là 2898,94 cm-1 và Gracilaria Heteroclada là 2931,80 cm-1. Trong agar, số nhóm liên kết C-H luôn không thay đổi cho dù tỉ lệ của galactose cũng như 3,6-anhydrogalactose và nhóm sulfate thay đổi. Vì vậy, có thể dùng cường độ hấp thụ của tần số này để định lượng tổng số đường agar (đại lượng đặc trưng cho tổng số đường của agar).
Bảng 3.6. Một số số sóng đặc trưng trong phổ trong phổ hồng ngoại (IR) của 02 mẫu agar chiết từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Số sóng dao động đặc Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
trưng (cm-1) 1460-1470 - - 1370 1369.46 1377.13 1200-1270 1247.94 1257 1067 - - 970 - 967.96
930 929.69 931.10 890 891.11 890.64 845 843.45 - 830 825 830 820 - - 770 769.60 772.75 734 735.6 734 719 717 717.12
Giải hấp thụ với tần số dao động hóa trị của liên kết –S=O là 1370 cm-1 (đối với dao động hóa trị phản đối xứng của nhóm O=S=O) và 1200 cm-1 – 1270 cm-1 (đối với dao động hóa trị đối xứng của nhóm O=S=O). Trong đó, cường độ hấp thụ của tần số của dạo động hóa trị phản đối xứng có cường độ yếu hơn [47]. Do vậy, trong một số tài liệu đã công bố, người ta chỉ sử dụng dao động hóa trị đối xứng với độ dao động trong vùng 1250 cm-1 để so sánh. Cường độ hấp thụ của tần số trên chỉ phụ thuộc vào số nhóm sulfate (SO42-) có trong agar mà không phụ thuộc vào nhóm sulfate đính vào C2, C4 hay C6. Do đó, có thể dựa vào cường độ hấp thụ của các tần số này để định lượng sulfate có trong agar. Cụ thể, đối với các mẫu nghiên cứu, rong Gracilaria Salicornia, xuất hiện giải hấp thụ ở tần số 1252,44 cm-1 ; còn với rong
Gracilaria Heteroclada, xuất hiện giải hấp thụ ở tần số 1247, 94 cm-1
Vì những lý do nêu trên, ta có thể dùng đại lượng tỷ lệ cường độ hấp thụ của các cặp tần số 1250 cm-1/2920 cm-1 làm đại lượng đặc trưng cho tỷ lệ SO42- / tổng số đường của mẫu agar.
Bảng 3.7. Tỉ lệ các cường độ hấp thụ của các cặp tần số
Mẫu 1250/2920
Gracilaria Salicornia 0,70
Như vậy theo kết quả bảng 3.7. thì tỉ lệ cường độ hấp thụ 1250/2920 của mẫu rong Gracilaria salicorrnia (0,70) thấp hơn mẫu rong Gracilaria Heteroclada (0,80) nên hàm lượng sulfate trong rong Gracilaria Salicornia
thấp hơn trong rong Gracilaria Heteroclada. Bảng 3.3. về kết quả phân tích thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ Gracilaria Heteroclada và rong Gracilaria Salicornia, chúng tôi cũng thu được hàm lượng sulfate của Gracilaria Salicornia là 0,45%, trong khi hàm lượng sulfate của Gracilaria Heteroclada là 0,70%. Điều đó chứng tỏ kết quả thu được từ phương pháp hóa học và giải phổ hồng ngoại IR là tương đồng với nhau.
Sự có mặt của monomer 3,6-anhydrogalactose (LA) trong agar được thể hiện ở tần số hấp thụ là 930cm-1, là dao động hóa trị của liên kết C-O trong 3,6-anhydrogalactose [44],[48]. Trên phổ IR của 02 mẫu rong nghiên cứu (Hình 3.10 và 3.11) thấy xuất hiện dao động với tần số 931,10 cm-1 của rong Gracilaria Salicornia và tần số 929,69cm-1 của rong Gracilaria Heteroclada.
Trên phổ hồng ngoại của các mẫu agar thông thường còn thấy xuất hiện các giải hấp thụ với tần số 1640cm-1. Tần số 1640cm-1 ứng với dao động hóa trị của phân tử nước (H2O) [45]. Đối với phổ Gracilaria Salicornia, có giải hấp thụ tương ứng ở tần số 1658,08 cm-1, còn với Gracilaria Heteroclada, sự xuất hiện của tần số hấp thụ là 1645,28cm-1 . Từ đó, chứng tỏ có sự dao động của các phân tử nước ở cả 02 loài rong trên.
Bảng 3.8. Tỉ lệ các cường độ hấp thụ của cặp tần số 930/2920
Mẫu 930/2920
Gracilaria Salicornia 0,90
Gracilaria Heteroclada 0,60
Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose của rong Gracilaria Salicornia (0,90) lớn hơn rong Gracilaria Heteroclada
(0,60). Và kết quả về hàm lượng 3,6-anhydrogalactose của 02 loài rong trên cũng được thể hiện tương tự trong bảng 3.3 - Thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ Gracilaria Heteroclada và rong
Gracilaria Salicornia. Cụ thể, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose của
Gracilaria Salicornia là 35,5%, còn đối với Gracilaria Heteroclada là 31,13%.
Như vậy, phương pháp phổ hồng ngoại IR không chỉ xác nhận sự tồn tại của các nhóm 3,6-L-anhydrogalactose và sulfate có trong 02 loài rong
Gracilaria Salicornia và Gracilaria Heteroclada, mà còn cóthể so sánh được hàm lượng sulfate và 3,6-anhydrogalactose của chúng. Từ đó, một lần nữa khẳng định việc phân tích hóa học có kết quả hết sức tin cậy.
Các vân phổ có dao động 1370, 1250, 930, 890, 770 cm-1 (bảng 3.6. và hình 3.10 và 3.11) tương ứng với sự có mặt của nhóm sulfate, 3,6- anhydrogalactose, và galactose đều xuất hiện trên phổ hồng ngoại của các mẫu nghiên cứu. Từ đó ta có thể xác định thành phần của các mẫu polysaccharide bao gồm cả ba thành phần trên: galactose, 3,6- anhydrogalactose và nhóm sulfate. Điều này phù hợp với kết quả phân tích thành phần hóa học chính của polysaccharide (bảng 3.3.)
Sự có mặt của đơn vị polymer (chuỗi liên kết) được tìm thấy trên phổ hồng ngoại của các mẫu agar được thể hiện bằng vân phổ 970 cm-1 tương ứng với dao động của disaccharide (agarobiose). Rõ ràng nhất là đối với phổ
Gracilaria Salicornia, có giải hấp thụ tương ứng ở tần số 967,9 cm-1 (hình 3.11.).
Kết luận: Qua các kết quả phân tích được từ phổ hồng ngoại IR của rong Gracilaria Salicornia và Gracilaria Heteroclada, ta thấy các phổ đều phản ánh đúng với cấu trúc agar dự kiến và phù hợp với kết quả phân tích hóa học cũng như các liên kết của các mẫu polysaccharide dạng agar.
3.2.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp mạnh trong việc nghiên cứu các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất polysaccharide nói riêng. Trên phổ NMR, không những cung cấp những thông tin về vị trí nhóm thế, vị trí liên kết mà chúng còn thể hiện sự khác nhau giữa các liên kết thông qua các tương quan giữa các liên kết trên phổ hai chiều.
Dựa vào phương pháp phân tích phổ hồng ngoại IR và phương pháp phân tích hóa học, chúng tôi đưa ra 04 dạng cấu trúc dự đoán của polysacccharide Bảng 3.9. Các dạng cấu trúc agar Ký hiệu Cấu trúc G [→3) β-D-galactose (1→] G’ [→3)6-O-Me-β-D-galactose (1→] A [→4)3,6-anhydro-α-L-galactose (1→] A’ [→4)2-O-Me-3,6-anhydro-α-L-galactose (1→]
Tỉ lệ lý tưởng đối với agar là DG và LA tương đương nhau. Từ kết quả phân tích thành phần chính trong bảng 3.3, tỉ lệ DG:LA trong các mẫu agar từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada (1,51) và Gracilaria Salicornia (1,13) đều lớn hơn 1 . Điều đó chứng tỏ sự có mặt của agaropectin dạng porphyran. Từ lập luận trên có thể cho rằng trong polysaccharide dạng agar chiết từ 02 loài rong trên có các dạng disaccharide sau: agarose và agaropectin. Kết quả này được phản ánh trên phổ NMR.
Rong Gracilaria Salicornia:
- Phổ C-NMR: được trình bày trong hình 3.12
Phổ 13C NMR của agarose trong Gracilaria Salicornia cho 12 tín hiệu tương ứng với 12 nguyên tử Carbon (C) có trong phân tử agarose, trong đó những tín hiệu ở vùng trường thấp thuộc về nguyên tử C-1 của gốc D-galactose (G1) với độ chuyển dịch hóa học là 102,61 ppm và C-1 của gốc 3,6-anhydro-L- galactose (A1) với độ chuyển dịch hóa học là 98,4 ppm. Thật vậy, theo công thức cấu tạo của monomer cơ bản của agar, chỉ duy nhất nguyên tử C ở các vị trí này chịu ảnh hưởng của sự liên kết với oxygen (O) nhiều nhất. Đó là hai liên kết với O ở vị trí α và một liên kết với O ở vị trí β. Nguyên tử C1 (G1) ở trường thấp nhất do nguyên tử C này chịu ảnh hưởng vòng pyranose với 3 nhóm –OH trong khi nguyên tử C1 (A1) chịu ảnh hưởng của vòng pyranose chỉ có 2 nhóm –OH. Cụm tín hiệu ở vùng trường cao thuộc về nguyên tử C-6 của gốc 3,6-anhdro-L-galactose (A6) do cùng chịu ảnh hưởng của ít liên kết
O nhất (1 liên kết O ở vị trí α, 1 liên kết O ở vị trí β), nguyên tử C6 (G6) là nguyên tử C của nhóm CH2 và nguyên tử C6 (A6) là nguyên tử C trong vòng pyranose với độ chuyển dịch hóa học là 69,90ppm.
Hình 3.12. Phổ 13C NMR của rong Gracilaria Salicornia
Do đó, nguyên tử C6 (G6) ở trường cao nhất. Cụ thể là độ chuyển dịch hóa học C ở G6 là 61,61 ppm và ở A6 là 69,90 ppm. Bằng cách tương tự kết hợp với dự liệu phổ của các công trình nghiên cứu [27], chúng tôi tạm thời