Mẫu 930/2920
Gracilaria Salicornia 0,90
Gracilaria Heteroclada 0,60
Kết quả từ bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose của rong Gracilaria Salicornia (0,90) lớn hơn rong Gracilaria Heteroclada
(0,60). Và kết quả về hàm lượng 3,6-anhydrogalactose của 02 loài rong trên cũng được thể hiện tương tự trong bảng 3.3 - Thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ Gracilaria Heteroclada và rong
Gracilaria Salicornia. Cụ thể, hàm lượng 3,6-anhydrogalactose của
Gracilaria Salicornia là 35,5%, còn đối với Gracilaria Heteroclada là 31,13%.
Như vậy, phương pháp phổ hồng ngoại IR không chỉ xác nhận sự tồn tại của các nhóm 3,6-L-anhydrogalactose và sulfate có trong 02 loài rong
Gracilaria Salicornia và Gracilaria Heteroclada, mà còn cóthể so sánh được hàm lượng sulfate và 3,6-anhydrogalactose của chúng. Từ đó, một lần nữa khẳng định việc phân tích hóa học có kết quả hết sức tin cậy.
Các vân phổ có dao động 1370, 1250, 930, 890, 770 cm-1 (bảng 3.6. và hình 3.10 và 3.11) tương ứng với sự có mặt của nhóm sulfate, 3,6- anhydrogalactose, và galactose đều xuất hiện trên phổ hồng ngoại của các mẫu nghiên cứu. Từ đó ta có thể xác định thành phần của các mẫu polysaccharide bao gồm cả ba thành phần trên: galactose, 3,6- anhydrogalactose và nhóm sulfate. Điều này phù hợp với kết quả phân tích thành phần hóa học chính của polysaccharide (bảng 3.3.)
Sự có mặt của đơn vị polymer (chuỗi liên kết) được tìm thấy trên phổ hồng ngoại của các mẫu agar được thể hiện bằng vân phổ 970 cm-1 tương ứng với dao động của disaccharide (agarobiose). Rõ ràng nhất là đối với phổ
Gracilaria Salicornia, có giải hấp thụ tương ứng ở tần số 967,9 cm-1 (hình 3.11.).
Kết luận: Qua các kết quả phân tích được từ phổ hồng ngoại IR của rong Gracilaria Salicornia và Gracilaria Heteroclada, ta thấy các phổ đều phản ánh đúng với cấu trúc agar dự kiến và phù hợp với kết quả phân tích hóa học cũng như các liên kết của các mẫu polysaccharide dạng agar.
3.2.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp mạnh trong việc nghiên cứu các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất polysaccharide nói riêng. Trên phổ NMR, không những cung cấp những thông tin về vị trí nhóm thế, vị trí liên kết mà chúng còn thể hiện sự khác nhau giữa các liên kết thông qua các tương quan giữa các liên kết trên phổ hai chiều.
Dựa vào phương pháp phân tích phổ hồng ngoại IR và phương pháp phân tích hóa học, chúng tôi đưa ra 04 dạng cấu trúc dự đoán của polysacccharide Bảng 3.9. Các dạng cấu trúc agar Ký hiệu Cấu trúc G [→3) β-D-galactose (1→] G’ [→3)6-O-Me-β-D-galactose (1→] A [→4)3,6-anhydro-α-L-galactose (1→] A’ [→4)2-O-Me-3,6-anhydro-α-L-galactose (1→]
Tỉ lệ lý tưởng đối với agar là DG và LA tương đương nhau. Từ kết quả phân tích thành phần chính trong bảng 3.3, tỉ lệ DG:LA trong các mẫu agar từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada (1,51) và Gracilaria Salicornia (1,13) đều lớn hơn 1 . Điều đó chứng tỏ sự có mặt của agaropectin dạng porphyran. Từ lập luận trên có thể cho rằng trong polysaccharide dạng agar chiết từ 02 loài rong trên có các dạng disaccharide sau: agarose và agaropectin. Kết quả này được phản ánh trên phổ NMR.
Rong Gracilaria Salicornia:
- Phổ C-NMR: được trình bày trong hình 3.12
Phổ 13C NMR của agarose trong Gracilaria Salicornia cho 12 tín hiệu tương ứng với 12 nguyên tử Carbon (C) có trong phân tử agarose, trong đó những tín hiệu ở vùng trường thấp thuộc về nguyên tử C-1 của gốc D-galactose (G1) với độ chuyển dịch hóa học là 102,61 ppm và C-1 của gốc 3,6-anhydro-L- galactose (A1) với độ chuyển dịch hóa học là 98,4 ppm. Thật vậy, theo công thức cấu tạo của monomer cơ bản của agar, chỉ duy nhất nguyên tử C ở các vị trí này chịu ảnh hưởng của sự liên kết với oxygen (O) nhiều nhất. Đó là hai liên kết với O ở vị trí α và một liên kết với O ở vị trí β. Nguyên tử C1 (G1) ở trường thấp nhất do nguyên tử C này chịu ảnh hưởng vòng pyranose với 3 nhóm –OH trong khi nguyên tử C1 (A1) chịu ảnh hưởng của vòng pyranose chỉ có 2 nhóm –OH. Cụm tín hiệu ở vùng trường cao thuộc về nguyên tử C-6 của gốc 3,6-anhdro-L-galactose (A6) do cùng chịu ảnh hưởng của ít liên kết
O nhất (1 liên kết O ở vị trí α, 1 liên kết O ở vị trí β), nguyên tử C6 (G6) là nguyên tử C của nhóm CH2 và nguyên tử C6 (A6) là nguyên tử C trong vòng pyranose với độ chuyển dịch hóa học là 69,90ppm.
Hình 3.12. Phổ 13C NMR của rong Gracilaria Salicornia
Do đó, nguyên tử C6 (G6) ở trường cao nhất. Cụ thể là độ chuyển dịch hóa học C ở G6 là 61,61 ppm và ở A6 là 69,90 ppm. Bằng cách tương tự kết hợp với dự liệu phổ của các công trình nghiên cứu [27], chúng tôi tạm thời đưa ra kết quả gán các tín hiệu ở các độ dịch chuyển hóa học tương ứng với các nguyên tử C có trong hai gốc D-galactose (G) và 3,6-anhydro – L- galactose (A)
Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 13C NMR của polysaccharide chiết từ loài rong Gracilaria Salicornia
C1 C2 C3 C4 C5 C6
DG(G) 102,61 70,44 82,41 68,94 75,55 61,61
LA (A) 98,4 70,06 80,3 77,54 75,82 69,90
Phổ 1H-NMR của các mẫu agar thông thường trong dung môi DMSO ở nhiệt độ 80oC thường thu được những tín hiệu 1H tương ứng với độ chuyển dịch hóa học từ 5,2 ppm đến 3,3 ppm. Trong phân tử agarobiose chỉ có nhóm
methin (CH) ở vị trí G1 và A1 là chịu ảnh hưởng của hai liên kết với nguyên tử oxy (liên kết α) và một liên kết với oxy ở vị trí β trong khi các nhóm methin (CH) khác chỉ chịu ảnh hưởng của một liên kết oxy ở vị trí α và một liên kết oxy ở vị trí β hoặc chỉ 2 liên kết với oxy ở vị trí β.
Hình 3.13. Phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Salicornia
Do nguyên tử oxy có độ âm điện lớn, kết quả là nhóm methin (CH) có nhiều liên kết với oxy sẽ dịch chuyển về trường thấp nhất. Nhưng ở đây, nguyên tử Hidro (H) của nhóm methin (A1) ở vị trí equatorial, còn của nhóm methin (G1) ở vị trí axial nên nguyên tử H (A1) phải ở trường thấp nhất ứng với độ dịch chuyển hóa học là δ = 5,135 ppm. Dựa vào phổ thực nghiệm và các dữ liệu phổ đã được thể hiện, chúng tôi đưa ra kết quả giải phổ dự đoán bằng việc gán các nguyên tử H vào các vị trí thích hợp trên bảng 3.11.
Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia
H1 H2 H3 H4 H5 H6
DG(G) 4,549 3,642 3,756 4,109 3,743 3,785
Để kiểm tra kết quả gán phổ 1 chiều cũng như xác định kiểu liên kết và vị trí liên kết, chúng tôi tiến hành phân tích phổ 2 chiều.
Phổ HSQC là một trong những công cụ hữu hiệu giúp ích cho việc tìm ra tương quan giữa các nguyên tử C-H liên kết trực tiếp với nhau. Dưới đây là hình 3.14., là phổ HSQC của rong Gracilaria Salicornia
Hình 3.14. Phổ HSQC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia
Trên phổ HSQC, dựa vào carbon anomer DG – C1, với độ dịch chuyển hoá học 102,61 ppm được xem như là điểm khởi đầu để xác định cấu trúc monome Galactose. Từ đây sẽ xác định được proton anomer tương ứng DG – H1 có độ dịch chuyển hoá học 4,549 ppm. Đây là độ dịch chuyển hoá học của H anomer. Từ một vị trí dễ nhận khác là DG-C6 là 61,61 ppm có thể xác định được DG-H6 là 3,785. Đối với gốc LA, điểm khởi đầu trên phổ HSQC cũng là carbon anomer LA – C1 tại 98,40 ppm, có liên hệ với proton LA – H1 tại 5,135 ppm. Đây là giá trị cộng hưởng của proton H anomer. Từ đây cho phép dự đoán liên kết glycoside tại carbon anomer của DG là liên kết kiểu và của LA là kiểu [36]. Như vậy, từ phổ HSQC đã xác định được các điểm mốc quan trọng là G-H1, G-H6 và A-H1.
Hình 3.15. Phổ COSY của agar có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia
Từ kết quả này, tương tác của các proton được phân tích và xác định
một loại phổ hai chiều, cho biết thông tin về mối tương quan giữa proton và proton
Trên phổ 1H-1H COSY (hình 3.16), mối tương quan giữa proton G- H1(4,549 ppm) và G-H2 ( 3,642 ppm) được thể hiện rất rõ thông qua peak đường chéo . Tương tác giữa G-H2 có độ chuyển dịch hóa học 3,642 ppm chính là tương tác giữa G-H3 (3,756 ppm). Từ với G-H3 (3,756 ppm) thông qua peak đường chéo, xác định được tương tác của G-H4, độ chuyển dịch hóa học của G-H4 là 4,109 ppm. Tương tác G-H4 và G-H5 không xác định được, nguyên nhân là do hằng số tương tác là quá bé nên không thể hiện được trên hình. Tuy nhiên từ giá trị tương tác của G-H6 (3,785 ppm) và G-H5 (3,743) cũng được tìm thấy trên phổ COSY đã thể hiện sự hiện diện của liên kết G5- G6
Bảng 3.12. Tín hiệu phổ COSY của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Salicornia
Proton/Proton Peak chéo (δ ppm) H-A1/H-A2 5,135/4,094 H-A2/H-A3 4,094/4,521 H-G1/H-G2 4,549/3,642 H-G2/H-G3 3,642/3,756 H-G3/H-G4 3,756/4,109 H-G5/H-G6 3,743/3,785
Xuất phát từ A-H1 (5,135 ppm) , A-H2 xác định được với độ chuyển dịch hóa học 4,094 ppm. Trên phổ tương tác giữa A-H2 với A-H3 được thể hiện rất rõ thông qua tín hiệu (4,094/4,521).
Bảng 3.13. Tín hiệu phổ HSQC của agar chiết kiềm từ rong Gracilaria Salicornia
Proton/Carbon Peak chéo ( Proton/Carbon Peak chéo (
ppm) ppm)
H-G2/C-G2 3,642/70,44 H-A2/C-A2 4,094/70,06
H-G3/C-G3 3,756/82,41 H-A3/C-A3 4,521/80,30
H-G4/C-G4 4,109/68,94 H-A4/C-A4 4,658/77,54
H-G5/C-G5 3,743/75,55 H-A5/C-A5 4,532/75,82
H-G6/C-G6 3,785/61,61 H-A6/C-A6 4,208/69,90
Các tương quan trên phổ COSY được thể hiện qua bảng 3.12. Từ độ chuyển dịch hóa học đã xác định trên phổ COSY thông qua tương tác trên phổ HSQC, độ chuyển dịch C và H tương ứng thể hiện trên bảng 3.13.
Nhận xét: Số liệu thu được từ phổ HSQC (bảng 3.13.) rất tương đồng với sự kết hợp số liệu từ phổ 1H NMR (bảng 3.10. ) và phổ 13C NMR (bảng 3.11.).
Ngoài ra, các cặp tín hiệu trên phổ HMBC cũng cho biết thông tin về tương quan giữa hai, ba và đôi khi bốn nối giữa Hidro và Carbon.
Bảng 3.14. Tín hiệu phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Salicornia
Proton/Carbon Peak chéo (δ ppm)
H-A1/C-A2 5,135/70,06 H-A1/C-G3 5,135/82,41 H-A2/C-A3 4,094/80,30 H-A2/C-G6 4,094/61,61 H-A3/C-A1 4,521/98,40 H-A3/C-A4 4,521/77,54 H-A3/C-A6 4,521/69,90 H-A4/C-A3 4,658/80,30 H-A4/C-A6 4,658/69,90 H-A4/C-G1 4,658/102,61
H-A5/C-A1 4,532/98,40 H-A5/C-A4 4,532/77,54 H-G2/C-G1 3,642/102,61 H-G2/C-G3 3,642/82,41 H-G3/C-G2 3,756/70,44 H-G6/C-G5 3,785/75,55
Hình 3.16. Phổ HMBC của agar chiết có xử lý kiềm từ rong Gracilaria Salicornia
Các cặp tín hiệu trên phổ HMBC này đã cho thấy sự tương quan giữa H-A1/C-G3 và H-A4/C-G1. Điều đó chứng tỏ có sự hiện diện của các liên
kết, cụ thể là liên kết giữa LA với DG là liên kết 1-3 glycoside (C1 của LA liên kết qua O glycoside với C3 của DG) và liên kết giữa DG với LA là liên kết 1-4 glycoside (C1 của DG liên kết qua O glycoside với C4 của LA). Cụ thể, trong mạch polysaccharide được cấu tạo chủ yếu từ β - D - galactopyranose và 3,6-anhydro-α-L-galactopyranose liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4 glycoside và α-1,3 glycoside thể hiện qua cấu trúc phân đoạn luân phiên giữa -G-A-G-
Rong Gracilaria Heteroclada
Hình 3.18. Phổ 13C NMR của rong Gracilaria heteroclada
Khác với phổ 13C NMR của loài rong Gracilaria Salicornia với 12 tín hiệu, trên phổ 13C NMR của Gracilaria Heteroclada thấy xuất hiện 16 tín hiệu tương ứng độ dịch chuyển hóa học từ 102,47 ppm đến 57,96 ppm. Ở vùng trường thấp, vùng anomer có 2 tín hiệu, tại 102,47ppm và 98,4ppm ứng với carbon anomer của galactose (DG) và 3,6-anhydrogalactose (LA). Các tín hiệu ở vùng từ 61,47-82,29 ppm là thuộc về carbon vòng pyrano từ C2 tới C6 của các gốc đường. 2 tín hiệu ở 59,15 và 57,96 ppm có thể do vị trí C6 của DG và C2 của (A) bị methyl hóa, điều này là rất phổ biến của agar có trong các chi rong Đỏ. Ngoài ra, tại vùng trường cao còn xuất hiện tín hiệu tương ứng với sự chuyển dịch hóa học là 17,37 ppm, chứng tỏ có sự methyl hóa – điều này được cụ thể hóa trong phổ 13C NMR mở rộng (hình 3.19)
Ảnh hưởng che chắn của nhóm thế không chỉ thể hiện ở các nguyên tử Carbon trong cùng một gốc mà còn ảnh hưởng tới cả Carbon ở gốc bên cạnh.
Nhóm methoxyl đính ở nguyên tử C2 của gốc 3,6-anhydro-L-galactose (A2) là thay đổi độ dịch chuyển hóa học của toàn bộ Carbon gốc D-galactose [27].
Hình 3.19. Phổ 13C NMR mở rộng của rong Gracilaria Heteroclada
Hiệu ứng chắn này thể hiện rõ nhất nếu nhóm thế là nhóm sulfate. Từ dữ liệu phổ thực nghiệm 13C NMR [27] của 4. O-methyl agaro -4-sulfate, ta thấy sự thế nhóm sulfate(SO42-) ở vị trí Carbon C-H (G4) của gốc D-galactose làm giảm độ chuyển dịch của nguyên tử C1 (A1) của gốc 3,6-anhydro-L- galactose (2 ppm) trong khi độ dịch chuyển hóa học của Carbon G1, G2 thay đổi không đáng kể
Theo các công trình đã nghiên cứu [49], [50], ảnh hưởng của hiệu ứng của nhóm CH3O- lên nguyên tử carbon tạo liên kết với nhóm CH3O- là độ dịch chuyển hóa học sẽ chuyển về phía trường thấp (độ dịch chuyển hóa học tăng lên 10 ppm), còn nguyên tử cacbon bên cạnh (hiệu ứng ) sẽ có các tín hiệu chuyển về phía trường cao (độ dịch chuyển hóa học giảm 1,7 ppm) và hiệu ứng của nguyên tử cac bon thứ ba sẽ là độ dịch chuyển hóa học tăng 0,3- 0,5 ppm.
Từ đó chúng tôi dự đoán độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử cacbon như sau:
(G6M-6) = (G6) + 10 = 62,04 + 10 = 72,04 ppm (G6M-5) = (G5) -1,7 = 75,9 - 1,7 = 74,2 ppm
(G6M-4) = (G4) +0,5 = 69,3 + ( 0,3-0,5) = 69,6-69,8 ppm.
Từ lập luận nêu trên, chúng tôi gán thêm 04 tín hiệu còn lại được đưa ra kết quả phân tích phổ 13C – NMR của agar chiết từ loài rong Gracilaria heterclada trên bảng 3.15. Đó là tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học 59,15 ppm của G6-OCH3, 57,96 ppm của G2-OCH3, 73,6 ppm của DG-6M – C5 và 70,19 ppm của DG-6M-C6.
Bảng 3.15. Kết quả phân tích phổ 13C NMR của polysaccharide chiết từ loài rong Gracilaria Heteroclada
C1 C2 C3 C4 C5 C6 6- OCH3 2- OCH3
DG(G) 102,47 69,89 82,3 68,81 75,43 61,47 59,15 57,96 LA (A) 98,4 69,46 80.7 77,4 75,68 69,07
DG-6M 73,6 70,19
Cũng như phổ 13C NMR, phổ 1H NMR của các mẫu agar chiết từ rong
Gracilaria Heteroclada phức tạp hơn phổ 1H NMR của Gracilaria Salicornia. Tại hình 3.20, phổ 1H NMR của Gracilaria Heteroclada thu được những tín hiệu với độ chuyển dịch hóa học từ 5,2 ppm đến 1,1 ppm, nhiều tín hiệu cộng hưởng so với loài rong Gracilaria Salicornia (độ chuyển dịch hóa học từ 5,2 ppm đến 3,3 ppm). Điểm đáng chú ý là sự xuất hiện tín hiệu cộng hưởng ở vùng trường cao tương ứng với độ chuyển dịch 1,167 ppm. Kết hợp với kết quả phân tích phổ 13C NMR cùng một số tài liệu tham khảo, chúng tôi gán cho tín hiệu này là của -CH3 (Me-).
Hình 3.20. Phổ 1H NMR của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
GracilariaHeteroclada
Hình 3.21. Phổ 1H NMR mở rộng của agar chiết có xử lý kiềm từ rong
Gracilaria Heteroclada
Từ các kết quả phổ 13C NMR và 1H NMR của Gracilaria Heteroclada,
Gracilaria Heteroclada theo phương pháp xử lý kiềm có sự methyl hóa tại G6 (CH3-O-G6), kết quả được thể hiện qua độ chuyển dịch hóa học tại δ=17.37 ppm trên hình 3.19 - phổ 13C NMR của Gracilaria Heteroclada, phân tử agar gồm 4 thành phần đường liên kết với nhau qua các liên kết 1-3 và 1-4 glycoside: G-A-G’-A’, trong đó, mức độ methyl hóa tại C6 của β-D-galactose cao hơn tại C2 của 3,6-anhydro-α-L-galactose. Với mức độ methyl hóa cao