Nồng độ 0,05 0,1 0,2 0,25
fructozo (µmol/mL)
Mật độ quang 0,241 0,282 0,367 0,409
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn Nồng độ (µmol/mL) – Mật độ quang. Sử dụng phần mềm Excel, chúng ta nhập số liệu để có được phương trình đường chuẩn như hình 3.6. Phương trình có dạng: D = 0,84C + 0,199 , trong đó C: nồng độ (µmol/mL) và D: mật độ quang
Hình 3.4. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng - nước bắt đầu đạt nhiệt độ 80oC
Hình 3.5. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố định 80oC sau 5 phút
Hình 3.6. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố định 80oC sau 10 phút
Kết quả phân tích thành phần hóa học chính của polysaccharide chiết tự nhiên (xử lý cồn) và chiết xử lý kiềm từ 2 loài rong Gracilaria Heteroclada
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ
Gracilaria Heteroclada và rong Gracilaria Salicornia
Thành phần hóa học Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
chính
Chiết tự Chiết xử lý Chiết tự Chiết xử nhiên (xử lý kiềm nhiên (xử lý lý kiềm
cồn) cồn)
Hiệu suất chiết (%) 28,5 21,9 27,6 18,9
Hàm lượng sulfate 5,1 0,7 2,3 0,45 (%) Hàm lượng 3,6- 18,79 31,13 26,7 35,5 anhydro-L-galactose và dẫn xuất của chúng (%) Hàm lượng agarose 32,1 69,1 35,6 78,9 (%) Hàm lượng 67,9 30,9 64,4 21,1 agaropectin (%)
Từ kết quả thu được ở bảng 3.3, chúng tôi có nhận xét sau:
- Thành phần chính của các mẫu polysaccharide là D-galactose (G), 3,6-L-anhydrogalactose (A) và sulfate (Bảng 3.3.). Sự có mặt của D- galactose, 3,6 anhydrogalactose và nhóm sulfate đã chứng tỏ rằng thành phần hóa học của polysaccharide là disaccharide agarobiose (G-A) đã được sulfate hóa. Tuy nhiên khi tính tỷ lệ mol (G) : (A), chúng tôi nhận được kết quả rất lý thú, đó là mẫu nghiên cứu đều có tỷ lệ số mol G lớn hơn rất nhiều so với số mol A. Từ đây, chúng tôi cho rằng trong các mẫu polysaccharide ngoài lượng chính galactose nằm trong các disaccharide dạng agarose còn một lượng đáng kể galactose nằm trong các disaccharide dạng agaran.
- Thành phần hóa học của các polysaccharide thay đổi theo điều kiện chiết. Đó là sau khi xử lý kiềm thì hàm lượng agarose và 3,6-
anhydrogalactose và các dẫn xuất của chúng tăng lên đáng kể. Sự thay đổi này còn phụ thuộc vào từng loài rong. Việc chiết polysaccharide từ rong có xử lý kiềm nhằm loại bỏ disaccharide porphyran thông qua phản ứng đóng vòng từ porphyran thành disaccharide agarobiose (hình 3.7) [39], làm tăng hàm lượng agarose.
Hình 3.7. Phản ứng chuyển hóa của porphyran sang agarose [40]
Với tất cả các mẫu polysaccharide nhận được khi chiết từ rong có xử lý kiềm, hàm lượng agarose đều tăng lên rõ rệt (hình 3.8.), điều này chứng tỏ rằng trong các mẫu polysaccharide chiết từ rong tự nhiên đều có chứa hàm lượng disaccharide porphyran nhất định và hàm lượng porphyran này thay đổi và sự thay đổi đó phụ thuộc vào polysaccharide chiết từ loài rong khác nhau.
Xử lý kiềm trong quá trình chiết agar ở nhiệt độ 80oC nhằm loại bỏ gốc sulfate không bền ở vị trí G6 trong phân tử agar làm tăng chất lượng của agar. Từ kết quả thu được từ bảng 3.3. cho thấy agar chiết từ rong có xử lý kiềm vẫn còn một lượng nhỏ sulfate (từ 0,45% đến 0,7%) chứng tỏ rằng nhóm sulfate trong phân tử agar không chỉ ở vị trí C6 axial không bền trong
monome (porphyran) mà còn ở vị trí C2, C4 equatorial bền vững của monome galactose và các nhóm sulfate ở vị trí bền này không bị tách khi bị xử lý kiềm.
Hiệu suất chiết Agarose % 90 78.9 80 70 69.1 60 50 40 32.1 35.6 30 20 10 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
Chiết tự nhiên Chiết có xử lý kiềm
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết agarose theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria
Salicornia
Như vậy dựa vào kết quả phân tích thành phần và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đưa ra nhận xét sơ bộ như sau:
- Phân đoạn agar chiết từ rong tự nhiên ngoài hai thành phần chính là galactose và 3,6-anhydrogalactose, còn có mặt của porphyran (agaropectin)
- Kết quả phân tích nhận được khẳng định sự có mặt của agarobiose và agaran trong polysaccharide chiết từ rong agarophite đúng như cấu trúc của agar đã được dự đoán
- Phân đoạn polysaccharide chiết tự nhiên (xử lý cồn) và có xử lý kiềm ở nhiệt độ khoảng 80oC có hàm lượng sulfate thấp và hàm lượng LA cao. Vậy, loại polysaccharide này là dạng agar có cấu trúc của chúng sẽ là agarose bị methyl hóa và sulfate hóa ở mức độ khác nhau tùy theo bản chất của loài rong. Và, agar này có khả năng tạo gel.
Để xác định tính chất gel của agar trong mỗi mẫu polysaccharide, chúng tôi xác định ba thông số quan trọng sau:
- Sức đông (g/cm2) - Nhiệt độ đông (oC) - Nhiệt độ tan đông (oC)
Kết quả được thể hiện trên bảng 3.4. như sau:
Bảng 3.4. Bảng thông số thể hiện khả năng tạo gel của hai loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Thông số Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
Chiết tự Chiết xử lý Chiết tự Chiết xử nhiên (xử lý kiềm nhiên (xử lý lý kiềm
cồn) cồn)
Sức đông (g/cm2) 98,7 380,5 120,5 520
Nhiệt độ đông (oC) 40,1 41,2 39,7 41,2
Nhiệt độ tan đông (oC) 79,6 90,1 89,5 87,8
Sức đông 2 g/cm 600 520 500 400 380.5 300 200 98.7 120.5 100 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
Chiết tự nhiênChiết có xử lý kiềm
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh sức đông của agar chiết theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria
Cũng như agar được chiết bằng phương pháp chiết tự nhiên (xử lý cồn) từ các loài Gracilaria ở các vùng trên thế giới như Mexico, Nam Mỹ, ... [41], [42], tương tự với các nước trong cùng khu vực châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Philippines..., agar chiết tự nhiên (xử lý cồn) từ loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia tại Việt Nam có sức đông thấp (dưới 100 g/cm2).Sức đông của Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia chiết tự nhiên (xử lý cồn) chỉ đạt khoảng 98,7 g/cm2 và 120,5 g/cm2. Thông qua biểu đồ hình 3.9, sức đông của agar có xử lý kiềm tăng lên đáng kể so với chiết tự nhiên (xử lý cồn) (khoảng 4 lần). Cụ thể, đối với rong
Gracilaria Heteroclada, sức đông tăng từ 98,7 g/cm2 đến 380,5 g/cm2, và rong Gracilaria Salicornia, sức đông tăng từ 120,5 g/cm2 lên 520 g/cm2.
Để ứng dụng agar trong công nghệ thực phẩm thì sức đông của agar phải trên 300 g/cm2, chính vì vậy, nhất thiết phải sử dụng phương pháp xử lý kiềm vì trong môi trường kiềm đã xảy ra phản ứng đóng vòng 3,6-anhydro từ porphyran (là tiền thân của agarobiose) và loại bỏ nhóm sulfate (vốn có nhiều trong agar tự nhiên thuộc chi Gracilaria) để tạo ra disaccharide agarbiose. Sự thay thế này đã làm thay đổi cấu trúc trong toàn bộ phân tử agar và hình thành mạng lưới gel ba chiều dẫn đến làm tăng sức đông gel agar [1], [37]. Nhờ có phương pháp chiết có xử lý kiềm, sức đông của agar sẽ tăng lên đáng kể, mang lại hiệu quả cao trong việc sử dụng agar, tăng chất lượng của agar thành phẩm.
Kết luận: Đối với 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
- Đã chiết (tự nhiên và có xử lý kiềm) được mẫu polysaccharide có hàm lượng từ 19% đến 29%.
- Mẫu polysaccharide có thành phần chính là: D-galactose (G), 3,6-L- anhydrogalactose (A) và sulfate.
- Đã xác định được tính chất gel của agar với 03 thông số: sức đông, nhiệt độ đông và nhiệt độ tan đông.
3.2. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA POLYSACCHARIDE TỪ 02 LOÀIRONG GRACILARIA SALICORNIA VÀ GRACILARIA HETEROCLADA RONG GRACILARIA SALICORNIA VÀ GRACILARIA HETEROCLADA
Mục đích của việc phân tích thành phần hóa học của mẫu polysaccharide thu được từ quá trình phân lập nhằm xác minh cấu trúc của sản phẩm thu được từ rong như thế nào. Để làm rõ cấu trúc hóa học của sản phẩm, chúng tôi sử dụng các phương pháp vật lý để phân tích cấu trúc bao gồm các phương pháp phân tích kết hợp của các phổ:IR, 13C NMR, 1H NMR, COSY, HMBC, HSQC.
3.2.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phương pháp IR là phương pháp đơn giản, thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vân phổ dao động tương ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử.
Trong phân tích cấu trúc polysaccharide, phương pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí các nhóm sulfate, các liên kết glycoside tồn tại trong agar, để từ đó nhận biết cấu trúc đặc trưng của chúng. Theo thống kê, ta có một số dao động sóng đặc trưng như bảng 3.5.
Bảng 3.5. Một số dao động đặc trưng của các nhóm nguyên tử và các liên kết trong agar [18], [43], [44], [45]
Loại dao động Số sóng Cường độ
(cm-1) IR Raman Dao động biến dạng của liên kết C-H trong 1460- Yếu Mạnh
nhóm CH3 1470
Dao động hóa trị phản đối xứng ( as) của 1270- Yếu Mạnh
nhóm O=S=O 1200
Dao động hóa trị đối xứng ( s) của nhóm 1370 Tr.bình Mạnh O=S=O
Dao động của liên kết C-O-C ( Liên kết 1067 Mạnh Mạnh glycoside)
Dao động của liên kết C-O-C (3,6- 930 Mạnh Tr.bình anhydrogalactoza)
Dao động biến dạng của liên kết C-H của 890 Mạnh nguyên tử C trong gốc -monome.
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C4 trong 845 Yếu Mạnh D-gal
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C2 trong 830 Yếu Mạnh D-gal
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C6 trong 820 Yếu Mạnh D-gal
Dao động của liên kết C-O-S ở vị trí C2 trong 800-805 Yếu Mạnh L-Angal
Dao động khung của vòng galactopyrannoza 770 Yếu Mạnh Dao động biến dạng của liên kết (1-3) C-O-C 734 Yếu Mạnh Dao động biến dạng của liên kết (1-4) C-O-C 719 Yếu Yếu
Phổ IR của rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia được trình bày trên hình 3.10. và hình 3.11.
%T 99 98 96 94 92 2149.20cm-1 772.75cm-1 90 88 890.64cm-1 86 931.10cm-1 84 967.96 82 1186.41 1658.08cm -1 1422.33 1042.23 80 1377.13cm-1 3595.96cm -1 2898.94cm -1 78 2947.09 1078.61cm-1 3189.50cm-1 76 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500400 4000 cm-1
Hình 3.11. Phổ IR của agar từ Gracilaria Salicornia
Giải hấp thụ ứng với tần số dao động hóa trị của liên kết C-H no là 2900cm-1 [46]. Trên phổ hồng ngoại của các mẫu agar nghiên cứu từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia (hình 3.10. và hình 3.11.) có xuất hiện giải hấp thụ ở tần số này, cụ thể Gracilaria Salicornia là 2898,94 cm-1 và Gracilaria Heteroclada là 2931,80 cm-1. Trong agar, số nhóm liên kết C-H luôn không thay đổi cho dù tỉ lệ của galactose cũng như 3,6-anhydrogalactose và nhóm sulfate thay đổi. Vì vậy, có thể dùng cường độ hấp thụ của tần số này để định lượng tổng số đường agar (đại lượng đặc trưng cho tổng số đường của agar).
Bảng 3.6. Một số số sóng đặc trưng trong phổ trong phổ hồng ngoại (IR) của 02 mẫu agar chiết từ 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Số sóng dao động đặc Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
trưng (cm-1) 1460-1470 - - 1370 1369.46 1377.13 1200-1270 1247.94 1257 1067 - - 970 - 967.96
930 929.69 931.10 890 891.11 890.64 845 843.45 - 830 825 830 820 - - 770 769.60 772.75 734 735.6 734 719 717 717.12
Giải hấp thụ với tần số dao động hóa trị của liên kết –S=O là 1370 cm-1 (đối với dao động hóa trị phản đối xứng của nhóm O=S=O) và 1200 cm-1 – 1270 cm-1 (đối với dao động hóa trị đối xứng của nhóm O=S=O). Trong đó, cường độ hấp thụ của tần số của dạo động hóa trị phản đối xứng có cường độ yếu hơn [47]. Do vậy, trong một số tài liệu đã công bố, người ta chỉ sử dụng dao động hóa trị đối xứng với độ dao động trong vùng 1250 cm-1 để so sánh. Cường độ hấp thụ của tần số trên chỉ phụ thuộc vào số nhóm sulfate (SO42-) có trong agar mà không phụ thuộc vào nhóm sulfate đính vào C2, C4 hay C6. Do đó, có thể dựa vào cường độ hấp thụ của các tần số này để định lượng sulfate có trong agar. Cụ thể, đối với các mẫu nghiên cứu, rong Gracilaria Salicornia, xuất hiện giải hấp thụ ở tần số 1252,44 cm-1 ; còn với rong
Gracilaria Heteroclada, xuất hiện giải hấp thụ ở tần số 1247, 94 cm-1
Vì những lý do nêu trên, ta có thể dùng đại lượng tỷ lệ cường độ hấp thụ của các cặp tần số 1250 cm-1/2920 cm-1 làm đại lượng đặc trưng cho tỷ lệ SO42- / tổng số đường của mẫu agar.