Ngoài các phân đoạn agarose và agaropectin, gần đây các nhà khoa học đã xác định được thành phần agaran không có khả năng tạo gel nhưng có hoạt tính sinh học quý trong rong Đỏ, Agaran có cấu tạo từ β-D-galactose và α-L- galactose liên kết với nhau qua các liên kết 1,4- và 1,3-glycoside.
1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦAPOLYSACCHARIDE POLYSACCHARIDE
Trong nghiên cứu cấu trúc polysaccharide dạng agar các vấn đề sau đòi hỏi cần được làm sáng tỏ:
Thành phần monosaccharide [định tính và định lượng, tức là loại và số lượng monosaccharide, cấu hình tuyệt đối (D hoặc L) và loại vòng (pyranoza hoặc furanoza)].
Các liên kết glycoside (cấu hình hoặc và vị trí liên kết) Chuỗi liên kết (trật tự sắp xếp của dãy monosaccharide)
Kết hợp giữa các phương pháp hóa học với các phương pháp sử dụng các thiết bị vật lý hiện đại trong nghiên cứu cấu trúc, việc phân tích cấu trúc của các polysaccharide bao gồm 5 bước chủ yếu:
1. Xác định thành phần monosaccharide bằng cách thuỷ phân mạch cacbohydrate để cắt các liên kết glycoside. Các nhóm thế có trong mạch được xác định bằng phổ hồng ngoại (IR)
2. Methyl hoá bằng các phản ứng hoá học để thu được các dẫn xuất monosaccharide, bằng cách nghiên cứu các dẫn xuất này có thể xác định được kiểu liên kết.
3. Ghi dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
4. Xác định trật tự liên kết glycoside và các vị trí nhóm thế bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ hồng ngoại kết hợp với phương pháp phân tích hóa học.
5. Nghiên cứu cấu trúc không gian dựa trên các số liệu phân tích phổ một chiều và hai chiều: 1H NMR, 13C NMR, HSQC, HMBC, COSY.
Các phương pháp phân tích cấu trúc
Từ năm1960 đến năm 1980, áp dụng các kỹ thuật mới trong việc nghiên cứu Agar như Fractionation, trong trao đổi Chromatography, Enzymic thoái biến và đặc biệt là 13C NMR quang phổ cho phép xác định chính xác hơn việc nghiên cứu cấu trúc hóa học cơ bản và trình tự sắp xếp của các nguyên tố trong các phân tử Agar.
Nghiên cứu gần đây của Yaphe (1971) trên DEAE-Sephadex chỉ ra rằng Agar chứa polysaccharide không tạo gel có cấu trúc của Agarose, ngoài ra, vẫn còn chứa đựng một lượng nhỏ Sulfate (0,1 đến 0,5%) và Pyruvic acid (0,02%).
Gần đây, 13C NMR quang phổ đã được xác nhận là một công cụ mạnh để làm sáng tỏ các Disaccharide lặp đi lặp lại của các đơn vị khác nhau trong Agarose hiện diện trong phân tử Agar khác.
Bên cạnh nhiệm vụ của chất hóa học sự thay đổi về vị trí trong 13C NMR quang phổ của nguyên tử khi carbon trong Agaroses chứa trong Agar cô lập từ nhiều loài Gracilaria, các cấu trúc và tính năng của Disaccharides có thể dễ dàng xác định.
1.3.1. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Quang phổ hồng ngoại (gọi tắt là quang phổ IR) là quang phổ được thực hiện ở vùng hồng ngoại của phổ bức xạ điện từ, ánh sáng vùng này có bước sóng dài hơn và tần số thấp hơn so với vùng ánh sáng nhìn thấy. Nhiều kỹ thuât về quang phổ hồng ngoại dựa trên tính chất này, mà hầu hết dựa trên cơ sở của sự hấp thụ quang phổ. Cũng giống như tất cả phương pháp quang phổ khác, quang phổ hồng ngoại có thể được sử dụng trong công tác xác định và nghiên cứu các hợp chất hóa học.
Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ngày nay là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và và phân tích các ionic polysaccharides nói riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharides như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển.
Bảng 1.1. Các nhóm đặc trưng của phổ FTIR trong phân tích polysaccharides Tần số (cm-1) Nhóm đặc trưng Liên kết Chất đặc trưng
1740 ν(C=O) Ester, pectin
1426 δ CH2 Cellulose
1371 δ CH2 Xyloglucan
1362, 1317 δ CH2 Cellulose
1243 ν(C-O) Pectin
1146 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Pectin
1130 ν(C-O-C) Glicoside, vòng Xyloglucan
1115 ν(C-O), ν(C-C) C-2-O-2 Cellulose
1100 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Pectin
1075 ν(C-O), ν(C-C) Vòng Xyloglucan
1060 ν(C-O), ν(C-C) C-3-O-3
1042 ν(C-O), ν(C-C) Vòng
1030 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6
1015, 1000 ν(C-O), ν(C-C) C-6H-2-O-6 Cellulose
1019 ν(C-O), ν(C-C) C-2-C-3, C-2-O-2, C-1- Pectin O-1 960 δ(CO) Pectin 944 δ(C-1-H) Cellulose Xyloglucan 895 Vòng Β-anomeric 833 Vòng Pectin
1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR ( phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H, 13C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.
Phổ H NMR1
Trong phổ 1H NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi proton cộng hưởng ở một trường khác nhau, vì vậy chúng được biểu diễn một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng
của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin giữa các hạt nhân với nhau mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
Phổ C NMR13
Phổ 13C NMR cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C NMR cũng được tính bằng ppm, với dãi thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0-240 ppm).
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharides. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharides thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1H NMR còn dùng để định lượng các polysaccharides có trong mẫu phân tích.
Phổ NMR được tín hiệu thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Trong phổ proton tất cả độ chuyển dịch hóa học của carbonhydrate bao gồm monosaccharide, oligosaccharide và polysaccharides có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6ppm trong chất chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học anomeric proton của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình α hay β. Như với α-anomeric proton sẽ xuất hiện tại δ 5-6ppm trong khi đó với β-anomeric proton là tại vùng δ 4- 5ppm. Mặc dù phổ 13C NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng cũng có những lợi thế so với phổ 1H NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharides bởi vì độ chuyển dịch hóa học trong phổ 13C NMR được trải rộng trên thang đo. Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H NMR. Trên phổ 13C NMR các tín hiệu anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 90-110ppm trong khi đó các tín hiệu của nonamoreic carbon xuất hiện tại vùng δ 60 và 80ppm. Với polysaccharides có nhóm deoxygen như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15-20ppm) [36]. Với hai loại anomeric proton, tín hiệu α-anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 100-105ppm. Với polysaccharides có chứa nhóm uronic acid, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170- 180ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60-
64ppm), trong khi độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranoser và C2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65-85ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển dịch về phía trường yếu 5-10ppm.
Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharides chưa xác định được ngay cấu trúc mà cần so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc phổ 2D NMR và một số kĩ thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharides. Tuy nhiên xuất hiện hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lượng polysaccharides. Do vậy phổ 13C NMR cũng có thể dùng để định lượng polysaccharides vì các tín hiệu anomeric của carbon được tách riêng trong phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1H NMR) có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu ( không có mặt các tín hiệu oligonucleotide, protein hay lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4ppm đến 5,8ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng monomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H NMR. Nhìn chung kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hóa học.
Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C HSQC.
Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình được suy ra từ các thông tin kết hợp có giá trị từ độ chuyển dịch hóa học 1H-NMR với hằng số tương tác vô hướng của C1, H1. Tương tác dị hạt nhân liên kết có thể thu được từ phổ tương tác 1H-13C HSQC.
Bảng 1.2. Độ chuyển dịch hóa học δ (ppm) từ cơ sở dữ liêu sugabase của dạng glucose, galactose và xylose dung môi D2O
Monosaccharide H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6a H-6b C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-6 α-D-Glcp 5.11 3.52 3.76 3.41 3.74 3.64 3.78 97.5 72.5 73.8 70.7 72.9 61.4 β-D-Glcp 4.84 3.31 3.55 3.51 3.55 3.77 3.94 102.9 74.1 76.3 70.4 76.0 61.5 α-D-Galp 5.16 3.89 3.93 4.12 4.11 3.73 3.73 99.1 68.9 70.2 68.6 71.0 61.7 β-D-Galp 4.68 3.53 3.80 4.08 3.74 3.74 3.74 103.5 71.7 73.5 67.9 75.5 61.8 α-D-Xylp 5.18 3.52 3.67 3.61 3.68(H5a) 93.12 72.44 73.75 70.16 3.60(H5b) 61.99 β-D-Xylp 4.57 3.22 3.43 3.62 3.31(H5a) 97.53 75.090 76.77 70.27 3.93(H5b) 66.05
Các vị trí được thế monosaccharides được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở vị trí không phải là anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí của liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hóa học của 13C so với độ chuyển dịch hóa học của các monomer không thế.
Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharides được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính xác cần xác định thu được từ các loại phổ hai chiều như HSQC, HMBC và COSY.
1.3.3. Phương pháp phổ hai chiều HSQC, HMBC, COSY
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysaccharide thông qua các tương tác giữa proton với proton và proton với carbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp.
Phổ HSQC
Phổ HSQC là phổ hai chiều dị hạt nhân 1H – 13C HSQC, cho biết sự liên quan giữa các tín hiệu của 1H (chiều w1) với các tín hiệu của 13C (chiều w2). Phổ HSQC có thể biểu diễn dưới dạng biểu đồ nổi hoặc biểu đồ đường viền, biểu đồ đường viền có nhiều ưu điểm hơn. Bởi vì những thông tin về độ dịch chuyển hóa học là khác nhau ở hai chiều cho nên phổ HSQC là không đối xứng qua đường chéo.
Phổ HSQC cho biết thông tin về những proton 1H đính trực tiếp với nguyên tử 13C. Ở các phổ HSQC, chỉ những tín hiệu của các nhóm CHn với n≥ 1 mới thấy được. Điều đó có nghĩa là không có các thông tin về những carbon bậc 4.
Phổ HMBC
Phổ HMBC là phổ hai chiều dị nhân 1H – 13C HMBC, thể hiện mối liên quan của tín hiệu proton 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử
13C khác ở cách nó 2, 3 liên kết do đó có tên là tương tác xa. Phổ HMBC thể hiện mối tương tác của 1H với nguyên tử 13C bậc 2 và bậc 3, có thể dự đoán vị trí các liên kết glycoside giữa các đơn vị đường trong polymer [36]. Nhờ vào các tương tác trên phổ này mà từng phần của phân tử cũng như toàn bộ phân tử được xác định về cấu trúc. Từ đây, cho phép dự đoán liên kết glycoside tại carbon anomer là liên kết kiểu α hay β.
Phổ 1H-1H COSY
Phổ COSY là phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY, biểu diễn các tương tác của H-H, chủ yếu là các proton đính với carbon liền kề nhau. Nhờ phổ này mà các phần của phân tử được nối ghép lại với nhau.
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU AGAR TRONG NƯỚC VÀ TRÊN THẾGIỚI GIỚI
1.4.1. Tình hình nghiên cứu agar trên thế giới
Những nghiên cứu về đặc điểm cấu trúc
Người đầu tiên nghiên cứu về agar là Payen từ năm 1859, từ loài rong Đỏ Gelidium amansii. Những công trình nghiên cứu sau này xác định sự có mặt của các đơn vị β-D-galactose, 3,6-α-anhydro-L-galactose, α-L-galactose trong agar. Cấu trúc khác nhau giữa các agar được tìm thấy chủ yếu là do các nhóm thế như sulfate, pyruvic acid ketal, methoxy hoặc xylose [13], [17]. Các nghiên cứu về cấu trúc agar dựa trên việc thủy phân agar thành các phân đoạn bằng phương pháp hóa học hoặc enzyme, sau đó các phân đoạn được phân tích cấu trúc bằng các kỹ thuật phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân ... [13].
Trong quá trình nghiên cứu đặc điểm cấu trúc, thành phần hóa học của các dạng agar, các nhà nghiên cứu thường quan tâm đến đặc điểm và vị trí các nhóm thế đã tạo ra sự khác biệt trong cấu trúc giữa các phân đoạn agar. Một số nhà nghiên cứu đã đưa ra kết luận rằng mức độ methyl hóa agar ở từng vị trí khác nhau thì khác nhau và tùy thuộc vào các loài rong, chi rong cũng như vị trí địa lý mà nó sinh sống. Năm 2006, Praiboon J. và cộng sự khi nghiên cứu về agar trong một số loài rong Gracilaria ở Thái Lan và Nhật Bản đã nhận thấy rằng agar chiết từ chi rong Gracilaria có mức độ methyl hóa ở vị trí C6 của monomer DG lớn hơn vị trí C2 của monomer LA [31]. Trong công trình nghiên cứu về cấu trúc hóa học và tính chất của agar chiết từ các loài rong chi Gracilaria năm 1995, Murano E. đã tổng kết rằng agar chiết từ các loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng methyl lớn hơn agar chiết từ chi rong Gelidium và Pterocladia [29].
Khi nghiên cứu về nhóm sulfate trong các phân đoạn agar, các tác giả đã cho rằng agar thường chứa hàm lượng sulfate nhất định, hàm lượng này ít nhiều phụ thuộc vào chi rong, loài rong mà agar được tách chiết ra. Agar chiết từ các loài rong thuộc chi Gracilaria có hàm lượng sulfate lớn hơn agar chiết từ chi rong Gelidium và Pterocladia [29]. Nhóm sulfate của L-galactose-6- sulfate có thể bị thủy phân trong kiềm tạo cầu nối 3,6-anhydro, làm tăng hàm
lượng agarobiose, dẫn đến tăng khả năng tạo gel của sản phẩm agar thu được [13]. Trong khi đó, nhóm thế pyruvic acid ketal trong agar tương ứng là 4.1% và 2.92%. Với Gelidiella acerosa (Barbados) làm lượng agar khô là 8,5%, hàm lượng sulfate và acid pyruvic trong agar tương ứng là 4,6% và 0,12%. Còn hàm lượng agar khô trong Gelidium sesquipedale (Tây Ban Nha) là 28,5%, hàm lượng sulfate và acid pyruvic trong agar tương ứng là 3,2% và 0,04% [13].
Theo nghiên cứu của các nhà khoa học như Karamanos và cộng sự [32] cũng như nhóm của Craigie [9] đã tìm thấy gốc 4-O-methyl-L-galactose tạo mạch nhánh qua liên kết O-C6 của β-D-galactose trong mạch chính của agar, trong các loài rong Gracilaria verrucosa và Gracilaria tikvahiae.
Đặc điểm agar trong rong Đỏ mang tính địa phương rõ rệt. Chúng phụ thuộc vào các yếu tố của môi trường sinh thái mà rong sinh sống như mực nước có ổn định không, nồng độ muối như thế nào, giàu hay nghèo chất dinh