CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp tách chiết polysaccharide dạng agar
Nguyên liệu: Rong phơi khô, bảo quản nơi khô ráo
Hóa chất: Nước cất, dung dịch NaOH các nồng độ, dung dịch H2SO4 0,01% - 0,1%
Dụng cụ: Cốc thủy tinh (các thể tích khác nhau), que khuấy thủy tinh, túi lọc, bếp điện...
Quy trình chiết tách agar cơ bản:
Hình 2.4. Quy trình chiết tách agar cơ bản [13]
Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu liên quan, chúng tôi đưa ra quy trình chiết sau:
Chiết agar tự nhiên:
Mẫu rong khô (15g) được ngâm trong cồn khoảng 1giờ để khử màu, sau đó được ngâm trong 400mL nước cất trong cốc thủy tinh để qua đêm.
Quá trình chiết được tiến hành bằng việc bổ sung thêm nước và đun sôi hỗn hợp trong cốc thủy tinh trên bếp điện với nhiệt độ cố định ở 80oC liên tục trong 3 giờ. Sau đó lọc thu lấy dịch bằng vải lọc, vắt kiệt lượng lỏng còn lại
trong rong và lọc lại lần hai thu được dịch lọc có màu vàng nâu và độ nhớt lớn khi nguội dần.
Dịch lọc được để nguội hẳn và được kết tủa bằng cồn trên bếp khuấy từ gia nhiệt. Kết tủa thu được là dạng keo sệt màu trắng hơi vàng đến vàng nâu.
Kết tủa được để qua đêm để kết khối, thuận lợi cho quá trình tách dung môi. Kết tủa sau khi qua đêm sẽ kết khối lại và lơ lửng trong hỗn hợp. Dung môi được loại bớt một phần bằng cách chắt bớt ra sau đó được loại hoàn toàn bằng máy ly tâm cao tốc với tốc độ 6000 vòng/phút và được thực hiện trong ít nhất 10 phút, thu được keo polysaccharide màu vàng nâu, giống thạch. Sau đó được đem đông khô để loại hết dung môi thu được polysaccharide khô, giòn, có màu trắng, vàng đến vàng nâu.
Tinh chế polysaccharide: Polysaccharide khô thu được sẽ được cho vào lọ thủy tinh rồi đem đun cho nóng chảy trên bếp khuấy từ gia nhiệt (vừa khuấy vừa đun) cho đến khi tan chảy hoàn toàn. Các cặn còn lại trong polysaccharides sẽ tách ra và nổi lên trên bề mặt keo hay chìm xuống dưới. Các cặn này được tách ra bằng cách cho ly tâm nóng keo tan chảy, khi đó cặn sẽ được loại bỏ và thu được polysaccharide sạch.
Chiết agar xử lý kiềm :
Quy trình chiết tương tự như chiết tự nhiên (xử lý cồn) nhưng thay thế quy trình xử lý cồn bằng quy trình xử lý kiềm NaOH với nồng độ 6%.
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của polysaccharide dạng agar
2.2.2.1. Xác định hàm lượng Carbohidrate
Bằng phương pháp Phenol-Sulfuric [37]:
Lấy 2 mL dung dịch cần xác định có nồng độ trong khoảng 40-100 µg/mL, thêm 0,1 mL dung dịch cồn phenol, lắc cho đến khi trong suốt. Thêm 10 mL acid sulfuric đậm đặc, lắc rồi để nguội, sau đó đun cách thủy ở nhiệt độ 60oC trong 10 phút, để nguội, đo trên UV ở bước sóng 484,5 nm.
2.2.2.2. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose
Bằng phương pháp Recorcinol [38], coi fructose như là chất chuẩn: Lấy 1 mL dung dịch cần xác định có nồng độ từ 0 đến 0,25 µmol/mL. Thêm 10 mL dung dịch thuốc thử Recorcinol – axetan ở nhiệt độ 20oC, lắc
trong 4 phút. Sau đó đun nóng đến 80oC trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá trong 1,5 phút, đo trên máy UV-VIS ở bước sóng 555 nm. Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh.
2.2.2.3. Xác định độ ẩm của rong
Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC.
Nguyên tắc của phương pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu.
Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ 100º-1100C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức:
Độ ẩm (%) = *100%
2.2.2.4. Xác định hàm lượng sulfate
Bằng phương pháp khối lượng [18]. ẫu được thủy phân hoàn toàn bằng dung dịch HCl 1M ở nhiệt độ 100°C trong 8 giờ. Dung dịch BaCl2 1M được thêm dư vào dung dịch thủy phân để tạo kết tủa BaSO4, ly tâm lấy tủa, sấy tủa ở 80ºC đến khối lượng không đổi. Sau đó định lượng BaSO4. Hàm lượng sulfate có trong mẫu được tính theo công thức sau:
DS(%) = DS: hàm lượng sulfate (%);
mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g);
m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g).
2.2.2.5. Xác định hàm lượng Agarose
Hòa tan polysacchaide dạng agar trong nước nóng có nồng độ 1mg/ml, sau đó lấy 1 ml dung dịch này cho vào 2 ml nhựa p-Sephadex A50. Sau đó khuấy nhẹ, để qua đêm và đem ly tâm lấy dung dịch nước có chứa agarose đem phân tích định lượng carbohydrate.
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc polysaccharide dạng agar
Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Đối với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (acid 4,4-dimethyl- 4-silapentane-1-sulfonic) được dùng làm chất chuẩn nội.
2.2.4. Phương pháp khảo sát tính chất gel
Sức đông (hay độ bền khả năng chịu đựng của gel) là trọng lực tối đa gel chịu được không bị rạn vỡ (g/cm2). Để xác định sức đông gel agar, trước hết phải điều chế dung dịch agar có nồng độ 1,5%. Đổ dung dịch vào ống khuôn, để yên 30 phút cho đông lại. Sau đó, gel được giữ ở 20oC qua đêm.
Các thông số sức đông, nhiệt độ đông, nhiệt độ tan đông, độ nhớt của dung dịch polysaccharide 1% trên máy Rheo Meter model CR-500DX. Sức đông của gel (g/cm2) được xác định bằng cách sử dụng thiết bị kiểm tra Gel Colloid Marine với đường kính 1,05 cm và tốc độ từ 16 – 18cm/phút. Nhiệt độ nóng chảy được xác định bằng cách đun trong nồi cách thủy cho đến khi polysaccharide tan chảy trong các ống chứa 10ml sol agar 1,5%. Điểm nóng chảy là nhiệt độ mà tại đó các hạt thủy tinh màu (rơi trên bề mặt gel trước khi các ống nghiệm được đặt trong nồi cách thủy) chạm vào đáy ống nghiệm.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN