Dựa trên cơ sở tham khảo các tài liệu liên quan, chúng tôi đưa ra quy trình chiết sau:
Chiết agar tự nhiên:
Mẫu rong khô (15g) được ngâm trong cồn khoảng 1giờ để khử màu, sau đó được ngâm trong 400mL nước cất trong cốc thủy tinh để qua đêm.
Quá trình chiết được tiến hành bằng việc bổ sung thêm nước và đun sôi hỗn hợp trong cốc thủy tinh trên bếp điện với nhiệt độ cố định ở 80oC liên tục trong 3 giờ. Sau đó lọc thu lấy dịch bằng vải lọc, vắt kiệt lượng lỏng còn lại
trong rong và lọc lại lần hai thu được dịch lọc có màu vàng nâu và độ nhớt lớn khi nguội dần.
Dịch lọc được để nguội hẳn và được kết tủa bằng cồn trên bếp khuấy từ gia nhiệt. Kết tủa thu được là dạng keo sệt màu trắng hơi vàng đến vàng nâu.
Kết tủa được để qua đêm để kết khối, thuận lợi cho quá trình tách dung môi. Kết tủa sau khi qua đêm sẽ kết khối lại và lơ lửng trong hỗn hợp. Dung môi được loại bớt một phần bằng cách chắt bớt ra sau đó được loại hoàn toàn bằng máy ly tâm cao tốc với tốc độ 6000 vòng/phút và được thực hiện trong ít nhất 10 phút, thu được keo polysaccharide màu vàng nâu, giống thạch. Sau đó được đem đông khô để loại hết dung môi thu được polysaccharide khô, giòn, có màu trắng, vàng đến vàng nâu.
Tinh chế polysaccharide: Polysaccharide khô thu được sẽ được cho vào lọ thủy tinh rồi đem đun cho nóng chảy trên bếp khuấy từ gia nhiệt (vừa khuấy vừa đun) cho đến khi tan chảy hoàn toàn. Các cặn còn lại trong polysaccharides sẽ tách ra và nổi lên trên bề mặt keo hay chìm xuống dưới. Các cặn này được tách ra bằng cách cho ly tâm nóng keo tan chảy, khi đó cặn sẽ được loại bỏ và thu được polysaccharide sạch.
Chiết agar xử lý kiềm :
Quy trình chiết tương tự như chiết tự nhiên (xử lý cồn) nhưng thay thế quy trình xử lý cồn bằng quy trình xử lý kiềm NaOH với nồng độ 6%.
2.2.2. Phương pháp xác định thành phần hóa học của polysaccharide dạng agar
2.2.2.1. Xác định hàm lượng Carbohidrate
Bằng phương pháp Phenol-Sulfuric [37]:
Lấy 2 mL dung dịch cần xác định có nồng độ trong khoảng 40-100 µg/mL, thêm 0,1 mL dung dịch cồn phenol, lắc cho đến khi trong suốt. Thêm 10 mL acid sulfuric đậm đặc, lắc rồi để nguội, sau đó đun cách thủy ở nhiệt độ 60oC trong 10 phút, để nguội, đo trên UV ở bước sóng 484,5 nm.
2.2.2.2. Xác định hàm lượng 3,6-anhydro-L-galactopyranose
Bằng phương pháp Recorcinol [38], coi fructose như là chất chuẩn: Lấy 1 mL dung dịch cần xác định có nồng độ từ 0 đến 0,25 µmol/mL. Thêm 10 mL dung dịch thuốc thử Recorcinol – axetan ở nhiệt độ 20oC, lắc
trong 4 phút. Sau đó đun nóng đến 80oC trong 10 phút, làm lạnh bằng nước đá trong 1,5 phút, đo trên máy UV-VIS ở bước sóng 555 nm. Mẫu đo tránh tiếp xúc với ánh sáng mạnh.
2.2.2.3. Xác định độ ẩm của rong
Theo phương pháp của Hiệp hội phân tích Mỹ AOAC.
Nguyên tắc của phương pháp xác định độ ẩm: dùng nhiệt để làm bay hơi nước có trong mẫu. Từ chênh lệch khối lượng mẫu trước và sau khi sấy, tính được độ ẩm của mẫu.
Thực nghiệm: Cân khoảng 5g mẫu trong đĩa đáy bằng, sấy ở nhiệt độ 100º-1100C tại áp suất khí quyển và sấy đến khối lượng không đổi. Độ ẩm của mẫu được tính theo công thức:
Độ ẩm (%) = *100%
2.2.2.4. Xác định hàm lượng sulfate
Bằng phương pháp khối lượng [18]. ẫu được thủy phân hoàn toàn bằng dung dịch HCl 1M ở nhiệt độ 100°C trong 8 giờ. Dung dịch BaCl2 1M được thêm dư vào dung dịch thủy phân để tạo kết tủa BaSO4, ly tâm lấy tủa, sấy tủa ở 80ºC đến khối lượng không đổi. Sau đó định lượng BaSO4. Hàm lượng sulfate có trong mẫu được tính theo công thức sau:
DS(%) = DS: hàm lượng sulfate (%);
mBaSO4: khối lượng của BaSO4 (g);
m: khối lượng mẫu thử nghiệm (g).
2.2.2.5. Xác định hàm lượng Agarose
Hòa tan polysacchaide dạng agar trong nước nóng có nồng độ 1mg/ml, sau đó lấy 1 ml dung dịch này cho vào 2 ml nhựa p-Sephadex A50. Sau đó khuấy nhẹ, để qua đêm và đem ly tâm lấy dung dịch nước có chứa agarose đem phân tích định lượng carbohydrate.
2.2.3. Phương pháp phân tích cấu trúc polysaccharide dạng agar
Phổ hồng ngoại (IR) được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ môn Hóa vô cơ – Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội.
Đối với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và được đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, trên máy Bruker AVANCE 500MHz tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, DSS (acid 4,4-dimethyl- 4-silapentane-1-sulfonic) được dùng làm chất chuẩn nội.
2.2.4. Phương pháp khảo sát tính chất gel
Sức đông (hay độ bền khả năng chịu đựng của gel) là trọng lực tối đa gel chịu được không bị rạn vỡ (g/cm2). Để xác định sức đông gel agar, trước hết phải điều chế dung dịch agar có nồng độ 1,5%. Đổ dung dịch vào ống khuôn, để yên 30 phút cho đông lại. Sau đó, gel được giữ ở 20oC qua đêm.
Các thông số sức đông, nhiệt độ đông, nhiệt độ tan đông, độ nhớt của dung dịch polysaccharide 1% trên máy Rheo Meter model CR-500DX. Sức đông của gel (g/cm2) được xác định bằng cách sử dụng thiết bị kiểm tra Gel Colloid Marine với đường kính 1,05 cm và tốc độ từ 16 – 18cm/phút. Nhiệt độ nóng chảy được xác định bằng cách đun trong nồi cách thủy cho đến khi polysaccharide tan chảy trong các ống chứa 10ml sol agar 1,5%. Điểm nóng chảy là nhiệt độ mà tại đó các hạt thủy tinh màu (rơi trên bề mặt gel trước khi các ống nghiệm được đặt trong nồi cách thủy) chạm vào đáy ống nghiệm.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. CHIẾT POLYSACCHARIDE VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓAHỌC CHÍNH HỌC CHÍNH
3.1.1. Kết quả của việc chiết polysaccharide và phân tích thànhphần hóa học phần hóa học
Hình 3.1. Hình ảnh nấu chiết agar từ rong Đỏ tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang
Đối tượng: rong Đỏ Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Quy trình tìm hiệu suất Agar- Agarose – Agaropectin Hiệu suất chiết polysaccharide: được tính với công thức
Hiệu suất chiết =
Trong đó, khối lượng polysaccharide và rong khô ban đầu có cùng đơn vị khối lượng.
Bảng 3.1. Số liệu từ quá trình chiết tách polysaccharide
Gracilaria Salicornia Gracilaria Heteroclada
Khối lượng rong khô đem 10 gram 10 gram
chiết
Khối lượng polysaccharides 2,76 gram 2,85 gram
Hiệu suất chiết 27,6% 28,5% polysaccharides
Khối lượng polysaccharides 1,89 gram 2,19 gram
chiết xử lý kiềm
Hiệu suất chiết 18,9% 21,9%
polysaccharides
Sự so sánh cụ thể được biểu diễn trong giãn đồ cột Hiệu suất chiết Polysaccharide
% 30 28.5 27.6 25 21.9 20 18.9 15 10 5 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia Chiết tự nhiên Chiết có xử lý kiềm
Hình 3.2. Biểu đồ so sánh hàm lượng agar chiết theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Từ số liệu bảng 3.1 và hình 3.2, hiệu suất chiết tự nhiên (xử lý cồn) của 2 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia tương ứng là 28,5% và 27,6% và hiệu suất chiết xử lý kiềm tương ứng là 21,9% và 18,9%. Trong đó chiết tự nhiên (xử lý cồn) có hiệu suất chiết cao hơn chiết có xử lý kiềm. Nguyên nhân của điều này là do việc nấu chiết trong môi trường kiềm ở nhiệt độ cao sẽ khiến agar bị cắt mạch mạnh và tan ra trong nước rửa nguyên liệu, làm giảm hiệu suất nấu chiết [13]. Theo một số tài liệu tham khảo thì hiệu suất chiết tự nhiên (xử lý cồn) của rong biển Việt Nam tương đương với rong biển vùng lân cận, nhưng lại thấp hơn so với rong biển ở vùng ôn đới. Gần
đây, nhóm nghiên cứu của Phân viện Vật liệu Nha Trang đã nghiên cứu sử dụng một số loài rong Gracilaria làm nguyên liệu sản xuất agar [7]. Nhưng nhìn chung, sản lượng không cao và chất lượng agar chỉ đạt tiêu chuẩn thực phẩm, không dùng được trong các lĩnh vực đòi hỏi chất lượng cao và chưa đủ khả năng để cạnh tranh với agar nước ngoài.
Để xác định loại cấu trúc chung của polysaccharide và lựa chọn các phương pháp thích hợp để nghiên cứu cấu trúc định lượng cũng như định hướng trong việc xác định tính chất gel và hoạt tính sinh học của polysaccharide chiết ở nhiệt độ khác nhau, chúng tôi tiến hành phân tích thành phần hóa học chính (agarose, sulfate, 3,6-anhydro-α-L-galactose và các dẫn xuất của chúng) của polysaccharide bằng phương pháp truyền thống là dựng đường chuẩn galactose bằng phương pháp đo mật độ quang. Kết quả đo mật độ quang được thể hiện qua bảng 3.2. và đường chuẩn hình 3.6.
Bảng 3.2. Giá trị mật độ quang tương ứng với nồng độ fructozo
Nồng độ 0,05 0,1 0,2 0,25
fructozo (µmol/mL)
Mật độ quang 0,241 0,282 0,367 0,409
Hình 3.3. Đồ thị đường chuẩn Nồng độ (µmol/mL) – Mật độ quang. Sử dụng phần mềm Excel, chúng ta nhập số liệu để có được phương trình đường chuẩn như hình 3.6. Phương trình có dạng: D = 0,84C + 0,199 , trong đó C: nồng độ (µmol/mL) và D: mật độ quang
Hình 3.4. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng - nước bắt đầu đạt nhiệt độ 80oC
Hình 3.5. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố định 80oC sau 5 phút
Hình 3.6. Sự thay đổi màu sắc theo thời gian đun nóng – nhiệt độ cố định 80oC sau 10 phút
Kết quả phân tích thành phần hóa học chính của polysaccharide chiết tự nhiên (xử lý cồn) và chiết xử lý kiềm từ 2 loài rong Gracilaria Heteroclada
Bảng 3.3. Thành phần hóa học của polysaccharide chiết từ loài rong Đỏ
Gracilaria Heteroclada và rong Gracilaria Salicornia
Thành phần hóa học Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
chính
Chiết tự Chiết xử lý Chiết tự Chiết xử nhiên (xử lý kiềm nhiên (xử lý lý kiềm
cồn) cồn)
Hiệu suất chiết (%) 28,5 21,9 27,6 18,9
Hàm lượng sulfate 5,1 0,7 2,3 0,45 (%) Hàm lượng 3,6- 18,79 31,13 26,7 35,5 anhydro-L-galactose và dẫn xuất của chúng (%) Hàm lượng agarose 32,1 69,1 35,6 78,9 (%) Hàm lượng 67,9 30,9 64,4 21,1 agaropectin (%)
Từ kết quả thu được ở bảng 3.3, chúng tôi có nhận xét sau:
- Thành phần chính của các mẫu polysaccharide là D-galactose (G), 3,6-L-anhydrogalactose (A) và sulfate (Bảng 3.3.). Sự có mặt của D- galactose, 3,6 anhydrogalactose và nhóm sulfate đã chứng tỏ rằng thành phần hóa học của polysaccharide là disaccharide agarobiose (G-A) đã được sulfate hóa. Tuy nhiên khi tính tỷ lệ mol (G) : (A), chúng tôi nhận được kết quả rất lý thú, đó là mẫu nghiên cứu đều có tỷ lệ số mol G lớn hơn rất nhiều so với số mol A. Từ đây, chúng tôi cho rằng trong các mẫu polysaccharide ngoài lượng chính galactose nằm trong các disaccharide dạng agarose còn một lượng đáng kể galactose nằm trong các disaccharide dạng agaran.
- Thành phần hóa học của các polysaccharide thay đổi theo điều kiện chiết. Đó là sau khi xử lý kiềm thì hàm lượng agarose và 3,6-
anhydrogalactose và các dẫn xuất của chúng tăng lên đáng kể. Sự thay đổi này còn phụ thuộc vào từng loài rong. Việc chiết polysaccharide từ rong có xử lý kiềm nhằm loại bỏ disaccharide porphyran thông qua phản ứng đóng vòng từ porphyran thành disaccharide agarobiose (hình 3.7) [39], làm tăng hàm lượng agarose.
Hình 3.7. Phản ứng chuyển hóa của porphyran sang agarose [40]
Với tất cả các mẫu polysaccharide nhận được khi chiết từ rong có xử lý kiềm, hàm lượng agarose đều tăng lên rõ rệt (hình 3.8.), điều này chứng tỏ rằng trong các mẫu polysaccharide chiết từ rong tự nhiên đều có chứa hàm lượng disaccharide porphyran nhất định và hàm lượng porphyran này thay đổi và sự thay đổi đó phụ thuộc vào polysaccharide chiết từ loài rong khác nhau.
Xử lý kiềm trong quá trình chiết agar ở nhiệt độ 80oC nhằm loại bỏ gốc sulfate không bền ở vị trí G6 trong phân tử agar làm tăng chất lượng của agar. Từ kết quả thu được từ bảng 3.3. cho thấy agar chiết từ rong có xử lý kiềm vẫn còn một lượng nhỏ sulfate (từ 0,45% đến 0,7%) chứng tỏ rằng nhóm sulfate trong phân tử agar không chỉ ở vị trí C6 axial không bền trong
monome (porphyran) mà còn ở vị trí C2, C4 equatorial bền vững của monome galactose và các nhóm sulfate ở vị trí bền này không bị tách khi bị xử lý kiềm.
Hiệu suất chiết Agarose % 90 78.9 80 70 69.1 60 50 40 32.1 35.6 30 20 10 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
Chiết tự nhiên Chiết có xử lý kiềm
Hình 3.8. Biểu đồ so sánh hiệu suất chiết agarose theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria
Salicornia
Như vậy dựa vào kết quả phân tích thành phần và tham khảo các tài liệu, chúng tôi đưa ra nhận xét sơ bộ như sau:
- Phân đoạn agar chiết từ rong tự nhiên ngoài hai thành phần chính là galactose và 3,6-anhydrogalactose, còn có mặt của porphyran (agaropectin)
- Kết quả phân tích nhận được khẳng định sự có mặt của agarobiose và agaran trong polysaccharide chiết từ rong agarophite đúng như cấu trúc của agar đã được dự đoán
- Phân đoạn polysaccharide chiết tự nhiên (xử lý cồn) và có xử lý kiềm ở nhiệt độ khoảng 80oC có hàm lượng sulfate thấp và hàm lượng LA cao. Vậy, loại polysaccharide này là dạng agar có cấu trúc của chúng sẽ là agarose bị methyl hóa và sulfate hóa ở mức độ khác nhau tùy theo bản chất của loài rong. Và, agar này có khả năng tạo gel.
Để xác định tính chất gel của agar trong mỗi mẫu polysaccharide, chúng tôi xác định ba thông số quan trọng sau:
- Sức đông (g/cm2) - Nhiệt độ đông (oC) - Nhiệt độ tan đông (oC)
Kết quả được thể hiện trên bảng 3.4. như sau:
Bảng 3.4. Bảng thông số thể hiện khả năng tạo gel của hai loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia
Thông số Gracilaria Heteroclada Gracilaria Salicornia
Chiết tự Chiết xử lý Chiết tự Chiết xử nhiên (xử lý kiềm nhiên (xử lý lý kiềm
cồn) cồn)
Sức đông (g/cm2) 98,7 380,5 120,5 520
Nhiệt độ đông (oC) 40,1 41,2 39,7 41,2
Nhiệt độ tan đông (oC) 79,6 90,1 89,5 87,8
Sức đông 2 g/cm 600 520 500 400 380.5 300 200 98.7 120.5 100 0
Gra. Heteroclada Gra. Salicornia
Chiết tự nhiênChiết có xử lý kiềm
Hình 3.9. Biểu đồ so sánh sức đông của agar chiết theo phương pháp tự nhiên và chiết xử lý kiềm của hai loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria
Cũng như agar được chiết bằng phương pháp chiết tự nhiên (xử lý cồn) từ các loài Gracilaria ở các vùng trên thế giới như Mexico, Nam Mỹ, ... [41], [42], tương tự với các nước trong cùng khu vực châu Á như Nhật Bản, Trung Quốc, Thái Lan, Philippines..., agar chiết tự nhiên (xử lý cồn) từ loài rong
Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia tại Việt Nam có sức đông thấp (dưới 100 g/cm2).Sức đông của Gracilaria Heteroclada và Gracilaria Salicornia chiết tự nhiên (xử lý cồn) chỉ đạt khoảng 98,7 g/cm2 và 120,5 g/cm2. Thông qua biểu đồ hình 3.9, sức đông của agar có xử lý kiềm tăng lên đáng kể so với chiết tự nhiên (xử lý cồn) (khoảng 4 lần). Cụ thể, đối với rong
Gracilaria Heteroclada, sức đông tăng từ 98,7 g/cm2 đến 380,5 g/cm2, và rong Gracilaria Salicornia, sức đông tăng từ 120,5 g/cm2 lên 520 g/cm2.
Để ứng dụng agar trong công nghệ thực phẩm thì sức đông của agar phải trên 300 g/cm2, chính vì vậy, nhất thiết phải sử dụng phương pháp xử lý kiềm vì trong môi trường kiềm đã xảy ra phản ứng đóng vòng 3,6-anhydro từ porphyran (là tiền thân của agarobiose) và loại bỏ nhóm sulfate (vốn có nhiều trong agar tự nhiên thuộc chi Gracilaria) để tạo ra disaccharide agarbiose. Sự thay thế này đã làm thay đổi cấu trúc trong toàn bộ phân tử agar và hình thành mạng lưới gel ba chiều dẫn đến làm tăng sức đông gel agar [1], [37]. Nhờ có phương pháp chiết có xử lý kiềm, sức đông của agar sẽ tăng lên đáng kể, mang lại hiệu quả cao trong việc sử dụng agar, tăng chất lượng của agar thành phẩm.
Kết luận: Đối với 02 loài rong Gracilaria Heteroclada và Gracilaria