1.3. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA
1.3.2. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR ( phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1H, 13C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu diễn bằng độ chuyển dịch hóa học.
Phổ H NMR1
Trong phổ 1H NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử.
Mỗi proton cộng hưởng ở một trường khác nhau, vì vậy chúng được biểu diễn một độ dịch chuyển hóa học khác nhau. Dựa vào những đặc trưng
của độ chuyển dịch hoá học và tương tác spin giữa các hạt nhân với nhau mà ta có thể xác định được cấu trúc hoá học của hợp chất.
Phổ C NMR13
Phổ 13C NMR cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13C NMR cũng được tính bằng ppm, với dãi thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0-240 ppm).
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharides. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharides thì phổ 1H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1H NMR còn dùng để định lượng các polysaccharides có trong mẫu phân tích.
Phổ NMR được tín hiệu thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Trong phổ proton tất cả độ chuyển dịch hóa học của carbonhydrate bao gồm monosaccharide, oligosaccharide và polysaccharides có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6ppm trong chất chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học anomeric proton của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình α hay β. Như với α-anomeric proton sẽ xuất hiện tại δ 5-6ppm trong khi đó với β-anomeric proton là tại vùng δ 4- 5ppm. Mặc dù phổ 13C NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng cũng có những lợi thế so với phổ 1H NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharides bởi vì độ chuyển dịch hóa học trong phổ 13C NMR được trải rộng trên thang đo. Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13C NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1H NMR. Trên phổ 13C NMR các tín hiệu anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 90-110ppm trong khi đó các tín hiệu của nonamoreic carbon xuất hiện tại vùng δ 60 và 80ppm. Với polysaccharides có nhóm deoxygen như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15-20ppm) [36]. Với hai loại anomeric proton, tín hiệu α-anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 100-105ppm. Với polysaccharides có chứa nhóm uronic acid, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170- 180ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C6 trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60-
64ppm), trong khi độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranoser và C2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65-85ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển dịch về phía trường yếu 5-10ppm.
Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharides chưa xác định được ngay cấu trúc mà cần so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc phổ 2D NMR và một số kĩ thuật khác. Phổ 1H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharides. Tuy nhiên xuất hiện hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu proton trong quá trình định lượng polysaccharides. Do vậy phổ 13C NMR cũng có thể dùng để định lượng polysaccharides vì các tín hiệu anomeric của carbon được tách riêng trong phổ. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1H NMR) có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu ( không có mặt các tín hiệu oligonucleotide, protein hay lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4ppm đến 5,8ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng monomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1H NMR. Nhìn chung kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hóa học.
Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1H-13C HSQC.
Dạng vòng (hexose hay furanose) và các cấu hình được suy ra từ các thông tin kết hợp có giá trị từ độ chuyển dịch hóa học 1H-NMR với hằng số tương tác vô hướng của C1, H1. Tương tác dị hạt nhân liên kết có thể thu được từ phổ tương tác 1H-13C HSQC.
Bảng 1.2. Độ chuyển dịch hóa học δ (ppm) từ cơ sở dữ liêu sugabase của dạng glucose, galactose và xylose dung môi D2O
Monosaccharide H-1 H-2 H-3 H-4 H-5 H-6a H-6b C-1 C-2 C-3 C-4 C-5 C-6 C-6 α-D-Glcp 5.11 3.52 3.76 3.41 3.74 3.64 3.78 97.5 72.5 73.8 70.7 72.9 61.4 β-D-Glcp 4.84 3.31 3.55 3.51 3.55 3.77 3.94 102.9 74.1 76.3 70.4 76.0 61.5 α-D-Galp 5.16 3.89 3.93 4.12 4.11 3.73 3.73 99.1 68.9 70.2 68.6 71.0 61.7 β-D-Galp 4.68 3.53 3.80 4.08 3.74 3.74 3.74 103.5 71.7 73.5 67.9 75.5 61.8 α-D-Xylp 5.18 3.52 3.67 3.61 3.68(H5a) 93.12 72.44 73.75 70.16 3.60(H5b) 61.99 β-D-Xylp 4.57 3.22 3.43 3.62 3.31(H5a) 97.53 75.090 76.77 70.27 3.93(H5b) 66.05
Các vị trí được thế monosaccharides được gọi là vị trí aglycon tương ứng với các nguyên tử C ở vị trí không phải là anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu NMR, vị trí của liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hóa học của 13C so với độ chuyển dịch hóa học của các monomer không thế.
Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharides được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính xác cần xác định thu được từ các loại phổ hai chiều như HSQC, HMBC và COSY.