CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập, tuyển chọn và định danh chủng nấm sinh tổng hợp laccase
a. Phương pháp phân lập và tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase
Thu thập các mẫu mùn cưa và nước thải từ các cơ sở chế biến gỗ và cống xả thải khu công nghiệp, đô thị tại địa bàn thành phố Đà Nẵng và tỉnh Thừa Thiên Huế để làm vật liệu nghiên cứu trong các thí nghiệm tiếp theo (Nguyễn, 2004).
Đối với mẫu mùn cưa:
Thu thập mẫu mùn cưa của các địa điểm cơ sở chế biến gỗ trên địa bàn thành phố Đà Nẵng và tỉnh Thừa Thiên Huế. Mỗi điểm thu 3 mẫu, mỗi mẫu 10 g, sau đó trộn 3 mẫu thành 1 mẫu, ghi ký hiệu mẫu, ngày thu mẫu, nơi lấy mẫu và đặc điểm của mẫu. Độ sâu tầng mùn cưa thu mẫu là 0 – 20 cm. Các mẫu mùn cưa được thu thập và bảo quản ở nhiệt độ phòng
Đối với mẫu nước thải:
Thu mẫu nước thải trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. Mỗi địa điểm thu 3 mẫu, mỗi mẫu 50 mL, sau đó trộn 3 mẫu thành 1 mẫu, ghi ký hiệu mẫu, ngày thu mẫu, nơi lấy mẫu và đặc điểm mẫu. Các mẫu nước thải được thu thập và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Các mẫu sau khi thu thập được tiến hành phân lập bằng phương pháp pha loãng (Nguyễn Lân Dũng et al., 2000) với môi trường phân lập Basal salts medium (BSM) chứa các thành phần: KH2PO4 0.2 g/L; MgSO4.7H2O 0.05 g/L; CaCl2.2H2O 0.01 g/L; CuSO4.5H2O 0.08 g/L; Na2MoO4.2H2O 0.05 g/L; MnSO4.H2O 0.033 g/L; ZnSO4. 7H2O 0.05 g/L có bổ sung guaiacol (0.01% ) (Xu et al., 2015)
Nghiền nhỏ 1 g mẫu mùn cưa, dùng nước nước cất pha loãng thành các dung dịch có nồng độ từ 10-1 đến 10-5. Sử dụng các nồng độ 10-3, 10-4, 10-5 cấy trang trên bề mặt môi trường phân lập trong một đĩa petri rồi nuôi ở 30ºC từ 5 – 8 ngày cho tới khi các tản nấm phát triển.
Chủng nấm sinh tổng hợp laccase được sàng lọc bằng cách quan sát theo dõi sự phát triển của nấm và sự thay đổi màu sắc của khu vực môi trường nuôi xung quanh khuẩn lạc. Nếu môi truờng quanh khuẩn lạc chuyển sang màu hồng đến nâu đỏ chứng tỏ có sự phân huỷ guaiacol của enzyme, qua đó cho thấy chủng nấm có khả năng sinh tổng hợp laccase (Xu et al., 2015). Sau đó chủng nấm được làm thuần bằng cách tiếp tục cấy truyền các tản nấm trên bề mặt môi trường peptone dextrose agar (PDA: 2% peptone, 20% dịch chiết khoai tây, 1.5% agar) ở 30°C từ 2 đến 3 lần.
Chủng nấm sau khi đã làm thuần được giữ giống theo phương pháp lạnh sâu ở -40ºC. Dùng pipet hút 0,5 mL glycerol đã thanh trùng vào ống eppendorf 1,5 mL đã được tiệt trùng. Sau đó dùng dao vơ trùng cắt lấy 1 - 3 miếng nhỏ môi trường chứa cả sợi và bào tử nấm sợi cho vào ống eppendorf 1,5 mL ở trên. Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút và bao băng parafilm sau đó dán nhãn. Mẫu trước tiên phải để ở 5°C (tạo điều kiện cho glycerol đi vào tế bào), sau đó được làm lạnh sâu -40°C (Nguyễn Lân Dũng et al., 2010). b. Phương pháp định danh chủng nấm phân lập được
Chủng nấm sau khi phân lập và tuyển chọn sẽ được định danh bằng 2 phương pháp gồm định danh bằng đặc điểm hình thái của chủng nấm và định danh bằng sinh học phân tử.
Định danh bằng đặc điểm hình thái:
Tiến hành quan sát trực tiếp chủng nấm trên môi trường PDA bằng mắt thường và quan sát dưới kính hiển vi quang học. Dựa vào hệ thống phân loại của De Hoog Guarro, Gené & Figueras (2000) để tiến hành định danh sơ bộ.
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm mốc trên môi trường PDA: • Khả năng phát triển của khuẩn lạc
• Màu sắc khuẩn lạc • Hình dạng khuẩn lạc • Bề mặt khuẩn lạc
• Đo kích thước khuẩn lạc
Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm mốc dưới kính hiển vi quang học:
Phương pháp này được tiến hành để quan sát đặc điểm sợi nấm, sự hình thành bào tử và đặc điểm của bào tử nấm. Sử dụng thuốc nhuộm Fuchsin kiềm để nhuộm sợi nấm rồi quan sát với kính hiển vi Eclipse 55i (Nikon, Nhật Bản) vật kính 40X (độ phóng đại 400 lần) (Vũ, 2001)
Định danh bằng sinh học phân tử
Sau khi định danh sơ bộ, chủng nấm này tiếp tục được định danh ở mức độ phân tử bằng kỹ thuật sinh học phân tử.
Tách chiết DNA tổng số:
Dịch nuôi cấy nấm trong môi trường peptone dextrose (PD: 2% peptone, 20% dịch chiết khoai tây) lỏng ở 30ºC, 180 vòng/phút sau 48 giờ được ly tâm 13 000 vòng/phút trong 10 phút để thu sinh khối nấm và tái huyền phù trong 500 µL đệm cetyltrimethyl amoni bromua (CTAB) (100 mM Tris-HCl, pH 8; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA; 2% CTAB; 0,2% β- mercaptoetanol), trộn đều mẫu bằng vontex. Sau đó bổ sung 40 µL SDS 20% và 500 µL CTAB. Hỗn hợp được trộn đều bằng vontex và ủ ở 65°C trong 30 phút rồi ly tâm 13 000 vòng/phút ở 37°C trong 15 phút thu dịch nổi. DNA tổng số được phân tách khỏi các thành phần của tế bào thông qua bổ sung hỗn hợp PCI (25 phenol: 24 chloroform: 1 isoamylalcohol) vào dung dịch với tỷ lệ 1:1, trộn đều và ly tâm 13.000 vòng / phút trong 15 phút ở 4°C. Khoảng 400 µL dịch nổi phía trên được chuyển vào ống eppendorf 1,5 mL mới và DNA tổng số được kết tủa bằng cách bổ sung isopropanol lạnh vào dung dịch với tỷ lệ (1:1). Tiến hành ủ mẫu ở -40°C trong 60 phút rồi ly tâm 13 000 vòng/phút trong 15 phút ở 4°C thu kết tủa DNA. Sau
đó rửa lại bằng 700 µL ethanol 70%, đảo nhẹ và ly tâm 10 000 vòng/phút trong 15 phút. Để khơ và tái hịa tan DNA trong 20 – 30 µL nước cất đã hấp tiệt trùng. Bảo quản ở -20°C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo (Huy et al., 2020).
Điện di gel agarose
Sau khi tách DNA tổng số thì sử dụng phương pháp điện di gel agarose để kiểm tra. DNA tổng số được chạy điện di trên gel argarose 1%, điện áp 80 V trong thời gian 30 phút, sử dụng thuốc nhuộm SafeViewTMClassic (Canada) theo khuyến cáo của nhà sản xuất. Sản phẩm thu được sẵn sàng tiếp tục thực hiện phản ứng khuếch đại bằng PCR.
Khuếch đại trình tự ITS
Khuếch đại đoạn gen mã hóa ITS của chủng nấm đã tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi có trình tự như sau (bảng 2.2):
Bảng 2.2. Trình tự cặp mồi ITS.
Mồi Trình tự mồi
ITS1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATG-3’
Thành phần phản ứng PCR : 40 ng DNA khn mẫu, 12,5 µL Master Mix 1x (Invitrogen, Mỹ); 1 µL primer ITS1 (10 pmol/ µL); 1 µL primer ITS4 (10 pmol/ µL) và thêm một lượng nước cất vơ trùng để được tổng thể tích là 25 µL. Q trình PCR khuếch đại gen ITS được thực hiện trong máy luân nhiệt (SimpliAmp, Applied Biosystems/ Thermo Fisher Scientific - Mỹ) có chu trình nhiệt: biến tính 95°C trong 5 phút; 30 chu kì nhiệt với mỗi chu kì là 95°C trong 1 phút, 55°C trong 1 phút và 72°C trong 1 phút 30 giây; cuối cùng là 72°C trong 10 phút.
Giải trình tự và xây dựng cây phả hệ
Kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE 1X ở 80V trong 30 phút và gửi giải trình tự tại Cơng ty First BASE Laboratories Sdn Bhd, Malaysia. Trình tự thu được được tra cứu trên Blast search (dựa trên dữ liệu của NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) để so sánh tính tương đồng của đoạn gen với những lồi nấm đã được định danh trong kho dữ liệu online nhằm định danh đến loài của chủng nấm này. Qua đó, xây dựng sơ đồ phả hệ bằng phần mềm MEGA phiên bản 6.0 với khả năng tối đa và giá trị boostrap của 500 lần lặp lại (Tamura et al., 2013).