CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.5. Xác định khối lượng protein từ chủng nấm phân lập được
Để xác định khối lượng protein của chủng nấm nghiên cứu, sử dụng phương pháp điện di polyacrylamide với SDS (SDS – PAGE) (Laemmli, 1970). Các phân tử protein bị biến tính bởi SDS, lúc đó protein duỗi thẳng và tích điện âm, do vậy chúng sẽ di chuyển về cực dương trong điện trường với tốc độ phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng. Thành phần acrylamide trong gel phụ thuộc vào khối lượng phân tử của protein được điện di (Stefan, 2000). Bản gel được đổ hai lớp, lớp dưới là seperating gel được đổ cách mặt trên 1,5 cm; để đông 30 phút, cài lược rồi đổ tiếp lớp stacking gel ở trên, để 30 phút cho gel đơng hồn tồn và ổn định. Bản gel sau đó được lắp vào hệ thống điện di BioRad.38
Bảng 2.3. Thành phần gel polyacrylamide.
Thành phần Seperating gel 12% Thành phần Stacking gel 5% Nước cất 1680 µL Nước cất 1500 µL Acrylamide 3% 1920 µL Acrylamide 3% 540 µL Seperating buffer 1200 µL Stacking buffer 800 µL APS 30 µL APS 20 µL TEMED 6 µL TEMED 4 µL
Chuẩn bị mẫu: Hút 15 µL dịch nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào và trộn đều với 15 µL loading dye 2X. Hỗn hợp được đưa vào gel điện di SDS-PAGE với stacking gel 5% và separating gel 12%.
Quá trình điện di sẽ chạy 2 lần:
- Lần 1 chạy với điện áp 100V trong 30 phút (khi mẫu chạy ra khỏi stacking gel). - Lần 2 chạy với điện áp 80V trong 180 phút (khi mẫu chạy ra khỏi seperating gel). Sau quá trình chạy điện di, bản gel được nhuộm với cơ chất ABTS trong đệm có độ pH tối ưu, lắc đều trong 15 – 20 phút để xác định vị trí các band protein. Sản phẩm sau khi nhuộm thì cho cho nước vào và có thể quan sát mẫu trực tiếp.
2.2.6. Xử lý số liệu
Số liệu thí nghiệm là trung bình cộng của 3 lần lặp lại. Các số liệu thực nghiệm được xử lí thống kê bằng phần mền Microsoft excel 2010. Kết quả thí nghiệm được biểu thị bằng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (M ± SD).