CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.3. Phương pháp khảo sát một số đặc điểm và động học enzyme
a. Khảo sát một số đặc điểm enzyme Ảnh hưởng của pH
Để khảo sát ảnh hưởng của pH lên enzyme và xác định pH tối ưu của enzyme từ chủng nấm nghiên cứu, tiến hành ủ dịch enzyme với ABTS được pha trong các đệm có pH thay đổi từ 2,5 - 9, bao bồm: glycine-HCl với pH từ 2,5 - 3; sodium acetate với pH từ 3,5 – 5,5, sodium phosphate với pH từ 6,5 - 8 và tris - HCl với pH từ 8,5 - 9 trong thời gian 10 phút ở nhiệt độ 30°C, sau đó thực hiện phản ứng enzyme để kiểm tra hoạt tính (Tian et al., 2014).
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Để khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên enzyme cũng như xác định nhiệt độ tối ưu của enzyme từ chủng nấm nghiên cứu, dịch enzyme được ủ và kiểm tra hoạt tính ở các nhiệt độ khác nhau. Hỗn hợp phản ứng bao gồm dịch enzyme, cơ chất ABTS, đệm có độ pH thích hợp được ủ ở các khoảng nhiệt độ từ 20°C - 70°C trong 10 phút. Hoạt tính của enzyme được xác định theo phương pháp đã nêu trên (Tian et al., 2014).
Ảnh hưởng của ion kim loại, phi kim
Để khỏa sát ảnh hưởng của các ion kim loại và phi kim lên enzyme từ chủng nấm nghiên cứu, dịch enzyme được ủ và kiểm tra hoạt tính với muối của các ion kim loại và phi kim bao gồm: Cu2+, Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe3+, Mn2+, I-, Cl-. Hỗn hợp phản ứng bao gồm dịch enzyme, cơ chất ABTS, ion kim loại/phi kim với nồng độ 1 mM, đệm có độ pH thích hợp được ủ ở nhiệt độ tối ưu trong 10 phút. Hoạt tính enzyme được xác định bằng phương pháp đã nêu trên (Tian et al., 2014).
b. Động học của phản ứng enzyme
Hai thông số động học là hằng số Michaelis Km và vận tốc phản ứng cực đại Vmax được xác định thông qua phản ứng giữa laccase và cơ chất ABTS ở các nồng độ 1 mM, 2 mM,
4mM, 6 mM, 8 mM, 10 mM và 50 mM. Hỗn hợp phản ứng bao gồm dịch enzyme, cơ chất ABTS ở các nồng độ nêu trên được ủ trong đệm có độ pH và nhiệt độ tối ưu trong 10 phút. Sản phẩm đường khử được tạo ra trong các phản ứng enzyme được tính tương đương với lượng ABTS theo đường chuẩn
Đồ thị phụ thuộc của tốc độ phản ứng (V) vào nồng độ cơ chất (S) được dựng lên. Xác định sự phụ thuộc giữa 1/V và 1/S, từ đó phương trình bậc nhất Lineweaver-Burk được thiết lập dưới dạng: 𝟏
𝑽= 𝑲𝒎 𝑽𝒎𝒂𝒙∗ 𝟏
[𝑺]+ 𝟏
𝑽𝒎𝒂𝒙 hay y = ax + b theo đó xác định được các thơng số động học của enzyme với cơ chất:
Trong đó: V được coi là số micromole giữa laccase và ABTS được giải phóng ra trong 1 phút, [S] được tính là nồng độ ABTS (đơn vị đo mM/mL).