4. Nội dung nghiên cứu
3.2. Xây dựng đường cong sinh trưởng và đường cong tích lũy enzyme của chủng Trametes
Trametes polyzona HUIBF21 3.2.1. Đường cong sinh trưởng
Theo dõi sự phát triển của chủng nấm T.polyzona HUIBF21 trên môi trường BSM lỏng, lắc 180 vòng/phút ở 30ºC. Kết quả được thể hiện ở hình 3.8 dưới đây
Hình 3.8. Đường cong sinh trưởng của T.polyzona HUIBF21 trong 15 ngày.
Dựa vào đồ thị đường cong sinh trưởng có thể thấy được chủng T.polyzona HUIBF21 có pha thích nghi kéo dài trong 6 ngày đầu nuôi cấy, lúc này chủng sinh trưởng chậm, trọng lượng khô xác định được trong 6 ngày đầu có tăng nhưng tăng chậm, dao động trong khoảng 50 – 55 mg. Đó là do lúc này tế bào cần một thời gian nhất định để thích nghi môi trường và tổng hợp các enzyme nhằm sử dụng được các chất dinh dưỡng mới.
Pha tăng trưởng bắt đầu từ ngày thứ 7 và kéo dài trong 6 ngày. Lúc này quá trình sinh trưởng của chủng nấm tăng rất mạnh, trọng lượng khô tăng gần gấp 2 so với những ngày đầu, và đạt trọng lượng khô cao nhất vào ngày thứ 12 là 190,92 mg, có được điều này là do chúng gặp điều kiện nuôi cấy thích hợp và dinh dưỡng dồi dào.
Tuy nhiên sang đến ngày thứ 13 thì sinh khối chủng lại bắt đầu giảm (pha cân bằng), sinh khối đạt hàm lượng 190,79 mg. Trong giai đoạn này, số lượng tế bào sống là không thay đổi, có thể do số lượng tế bào mới sinh ra cân bằng với số lượng tế bào chết đi, hoặc là do chủng nấm ngừng sinh sản mà vẫn giữ nguyên hoạt tính trao đổi chất.
Tế bào bước vào pha ổn định chủ yếu là do sự hạn chế của chất dinh dưỡng, nếu một chất dinh dưỡng thiết yếu bị thiếu hụt nghiêm trọng thì sự sinh trưởng sẽ chậm lại. Pha cân bằng của chủng T.polyzona HUIBF21 kéo dài trong 3 ngày, sang đến ngày thứ 15, kết thúc pha cân bằng, sinh trưởng của chủng giảm còn 183,09 mg và bước vào pha suy vong. Lúc này việc tiêu hao chất dinh dưỡng và việc tích lũy các chất thải độc hại làm tổn thất đến môi trường sống của vi sinh vật, làm cho số lượng tế bào sống giảm xuống. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với lý thuyết về sinh trưởng của vi sinh vật (Lân et al., 2010)
3.2.2. Đường cong tích lũy enzyme ngoại bào
Để xây dựng đường cong tích lũy enzyme ngoại bào của chủng nấm T.polyzona
HUIBF21, tiến hành nuôi cấy lỏng trong môi trường sinh tổng hợp laccase BSM bổ sung 10% D-glucose ở 30°C, lắc 180 vòng/phút. Kết quả theo dõi sau 15 ngày nuôi được thể hiện ở hình 3.9
Hình 3.9. Đường cong tích lũy enzyme của chủng T.polyzona HUIBF21 trong 15 ngày. Kết quả nghiên cứu cho thấy sau 3 ngày đầu nuôi cấy, hoạt độ laccase xác định được là 213 U/ml ± 0.46 do ở thời điểm này chủng đang phải trải qua quá trình thích nghi với môi trường, quá trình trao đổi chất diễn ra chậm.
Từ ngày 6 đến ngày 9, chủng nuôi đã dần thích nghi với môi trường, mặc dù lượng sinh khối tăng không nhiều (kết quả thể hiện ở đường cong sinh trưởng) quá trình tổng hợp enzyme tăng hơn 3 ngày đầu và hoạt độ thu được lần lượt đạt 246,6389 U/ml ± 0.41 và 296,5278 U/ml ± 0.52. Điều này cũng có thể cho thấy laccase từ chủng nấm nghiên cứu là enzyme được tổng hợp ở pha sớm của quá trình sinh trưởng.
Ở những ngày theo dõi tiếp theo, hoạt độ laccase tiếp tục tăng nhanh cùng với quá trình phát triển sinh khối tế bào và đạt ngưỡng cao nhất ở 12 (đầu pha cân bằng) ngày nuôi do gặp điều kiện nuôi cấy thích hợp sinh khối tế bào tăng nhanh, các hoạt động trao đổi chất diễn ra thuận lợi nên lượng enzyme tổng hợp được nhiều, hoạt độ enzyme xác định được ở thời điểm này là 434,0278 U/ml ± 0.23.
trưởng của chủng nấm có mối quan hệ mật thiết với khả năng tích lũy enzyme ngoại bào của chủng T.polyzona HUIBF21. Kết quả này được dùng cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.3. Khảo sát một số đặc điểm và động học enzyme ngoại bào
3.3.1. Môt số đặc điểm enzyme từ chủng nấm T.polyzona HUIBF21
a. Ảnh hưởng của pH
Độ pH có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng của enzyme. Bởi pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc axit amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và ion hóa cơ chất. Để tìm ra khoảng pH tối ưu cho hoạt động của laccase từ chủng T.polyzona HUIBF21, hoạt độ enzyme đã được xác định thông qua việc sử dụng dịch enzyme và các đệm có pH khác nhau từ pH 2,5 đến pH 9. Hoạt tính laccase được thể hiện thông qua mức độ xanh đậm hay nhạt của sản phẩm tạo thành do cơ chất ABTS bị oxy hóa được thể hiện qua sơ đồ sau (hình 3.10).
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH lên enzyme.
Qua hình 3.10 ta thấy, khi pH tăng từ 2,5 đến 3, hoạt độ enzyme cũng tăng từ 42,3% (171,02 U/mL ± 10,15) đến 84,1% (339,95 U/mL ± 12,34). Laccase do T.polyzona HUIBF21 sinh tổng hợp có hoạt động xúc tác phản ứng mạnh nhất ở pH 3,5, tại đây hoạt độ laccase đo được là 404,21 U/mL ± 3,32 với hiệu suất 100%. Từ ngưỡng pH 3,5 đến 6,5, hoạt động của enzyme giảm mạnh còn 9,83% (39,72 U/mL ± 7,34). Từ ngưỡng pH 7 đến 9, laccase gần như
bị bất hoạt. Vì vậy có thể khẳng định laccase của chủng T.polyzona HUIBF21 sinh tổng hợp có hoạt động xúc tác phản ứng mạnh nhất trong khoảng pH acid từ 3,5 đến 5 tương đương so với một số chủng nấm sinh laccase khác như Trametes trogii, Trametes versicolor,
Melacarpus albomyces, Marasmius quercophilus…có pH hoạt động tối ưu của các chủng nói
trên lần lượt là pH 2; 3; 3,5 và 4,5 (Bar, 2001). b. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hưởng tới hoạt độ, mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của laccase được xác định qua việc đo hoạt độ enzyme ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau từ 20°C đến 70°C. Kết quả thu được như sau (hình 3.11)
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên enzyme.
Kết quả từ hình 3.11 cho thấy khi nhiệt độ tăng dần từ 20°C đến 45°C hoạt độ laccase cũng tăng dần từ 63,61% (291.39 U/mL ± 10.47) đến 94,4% (432,59 U/mL ± 35.8) , nhiệt độ thích hợp nhất cho laccase hoạt động là vào khoảng 50°C, hoạt độ enzyme xác định được lên tới 100% với 458,102 U/mL ± 12.25. Ở ngưỡng 55°C, phản ứng của enzyme bắt đầu giảm chỉ còn khoảng 89,07% (408 U/mL ± 33.7) so với nhiệt độ tối ưu 50°C. Và khi tăng nhiệt độ lên tới 70°C, phản ứng enzyme – cơ chất giảm chỉ còn 63,48% (290.79 U/mL ± 25.8). Như vậy nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase nấm T.polyzona HUIBF21 tương tự chủng
như Pycnoporus sanguineus là 55ºC và 3 loại laccase của Coprinellus micaceus là pool 1, pool 2, pool 3 tương ứng là 65°C, 60°C, 65°C (Niladevi and Prema, 2005).
c. Ảnh hưởng của ion kim loại và phi kim
Sự có mặt của ion kim loại đã ảnh hưởng đến enzyme theo nhiều cơ chế khác nhau, nó có thể làm tăng hay giảm khả năng xúc tác của enzyme. Ngoài ra, các ion kim loại đóng vai trò quan trọng trong việc định hình cấu trúc không gian của phân tử enzyme hoặc trong một vài trường hợp nó là nhân tố cần thiết trong trung tâm hoạt động của enzyme. Do đó ion kim loại có ảnh hưởng lớn tới khả năng hoạt động của enzyme. Chính vì vậy việc xác định ảnh hưởng ion kim loại là một trong những cơ sở định hướng sản xuất enzyme ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Sau 1 giờ ủ 50 µL dịch enzyme cùng các ion kim loại khác nhau: Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Cl-, I- nồng độ 1mM ở 50°C, hoạt độ của enzyme được xác định ở hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của ion kim loại và phi kim.
Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính laccase cho thấy rằng hoạt tính của enzyme đã được tăng cường với sự hiện diện của các kim loại Cu2+, Zn2+, Mn2+, Ca2+ và Mg2+ ở nồng độ 1 mM (hình 3.12). Trong đó, ion Cu2+ tăng cường mạnh mẽ hoạt động của enzyme, làm tăng hoạt tính tương đối lên đến 100%. Như vậy Cu2+ có thể đóng vai trò nhờ cofactor của enzyme, tham gia vào hoạt động xúc tác tại trung tâm hoạt động của enzyme.
Sự hiện diện của Mn2+, Ca2+ và Zn2+ ảnh hưởng tương đối đến các hoạt tính enzyme dưới 80%. Những điều này cho phép suy luận rất có thể chúng liên kết tương đối yếu với trung tâm hoạt động enzyme laccase. Ngoài ra, hoạt động của laccase được kích thích bởi ion Mg2+, có thể do sự pha trộn của ion Mg2+ là cần thiết cho các vị trí xúc tác và cấu trúc protein. Theo đó, sự hiện diện của ion Mg2+ làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của protein và làm hoạt tính enzyme tăng.
Với các ion phi kim Cl- và I- có tác dụng ức chế nhẹ hoạt động của enzyme này, hoạt độ thu được còn lại sau khi xử lý còn lại dưới 20%.
Đồng thời, khác với các enzyme khác, laccase có cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Tuy nhiên, hoạt tính laccase đã hoàn toàn bị ức chế bởi việc bổ sung ion Fe3+. Chứng tỏ ion Fe3+ có khả năng không liên kết với trung tâm hoạt động enzyme. Điều này có thể giải thích là do sự tương tác của ion Fe3+ với nhóm S - S hoặc –SH của laccase hình thành phức hợp laccase - Fe, làm thay đổi cấu hình và giảm hoạt động của enzyme.
3.3.2. Động học enzyme
Giá trị Km và Vmax đặc trưng cho tính đặc hiệu của mỗi loại enzym đối với mỗi loại cơ chất. Hằng số Km của phản ứng enzyme được xác định bởi dải nồng độ ABTS từ 1 đến 10 mM/mL. Dựa vào sản phẩm tạo thành của phản ứng giữa enzyme với cơ chất ở các nồng độ khác nhau chúng tôi đã xây dựng đồ thị phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất ABTS theo phương pháp của Linewever-Burk (hình 3.13) và các thông số động học Km, Vmax được xác định.
Kết quả cho thấy, phương trình phụ thuộc giữa tốc độ phản ứng với nồng độ cơ chất ABTS đã tuân theo hàm y = 0.0014x + 0.0002 với độ tin cậy 99,83% (R2 = 0.9983). Khi tăng nồng độ cơ chất ABTS từ 1 – 10 mM/mL thì nồng độ sản phẩm tạo thành tăng dần nghĩa là vận tốc phản ứng tăng dần từ 0,00014 µM/phút đến 0,0014 µM/phút. Khi nồng độ cơ chất quá 10 mg/mL thì tốc độ phản ứng không tăng, đồ thị đi ngang (hình 3.13). Giá trị Km và Vmax trong thí nghiệm này được tính tương ứng là 7 mM và 5000 µM/phút, thấp hơn so với Km và Vmax laccase của T.versicolor là 12,8 mM và 8125,4 µM/phút (Han et al., 2005).
3.4. Khả năng phân hủy thuốc nhuộm tổng hợp của enzyme
Dịch enzyme thu từ chủng nấm T.polyzona HUIBF21 được ứng dụng trong việc phân hủy màu thuốc nhuộm thuộc nhóm azo, anthraquinon, tricrymethano, chất chỉ thị màu và muối hữu cơ được tìm thấy nhiều trong các phòng nghiên cứu và nước thải khu công nghiệp như nhà máy dệt nhuộm,.... Khả năng khử màu thuốc nhuộm tổng hợp của chủng nấm nghiên cứu thể hiện trong hình 3.14 và hình 3.15.
Hình 3.14. Hình ảnh khử màu thuốc nhuộm tổng hợp của laccase sau 24 giờ.
(A: Methylen blue; B: Anillin blue; C: Evans blue; D: Remazol Brilliant blue; E: Reactive black; F: Crystal violet; G: Orange II; H: Methyl orange; I: Indigo carmin; K: Machite
Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy thuốc nhuộm tổng hợp của laccase sau 24 giờ.
Nhìn chung, T. polyzona HUIBF21 đã loại bỏ thuốc nhuộm tổng hợp ở mức độ khác nhau sau 24 giờ. Hiệu suất khử màu được thể hiện tối đa trên Crystal Violet với mức độ xấp xỉ 75%. Trong khi đó, T. polyzona HUIBF21 loại bỏ từ 20 – 40 % đa số các thuốc nhuộm (Anilin Blue, Remazol Brilliant blue, Orange II, Indigo Carmin, Malachite Green và Bromphenol Blue) và nhỏ hơn 20% với các màu thuốc nhuộm còn lại (Methylen blue, Evans Blue, reactive Black, Methyl Orange). Các hiệu suất này thấp hơn rất nhiều so với chủng
Trametes versicolor gần như loại bỏ 100% màu thuốc nhuộm tổng hợp sau 24 giờ (Wang and
Yu, 1998).
3.5. Xác định khối lượng phân tử laccase ngoại bào
Hình 3.16. Kết quả hình ảnh điện di SDS – PAGE của protein laccase.
M: Thang phân tử protein (hãng Thermo Sciencetific); 1: Laccase biến tính với SDS; 2: Laccase không bị biến tính với SDS.
Khối lượng laccase ngoại bào của chủng T. polyzona HUIBF21 được xác định thông qua điện di phân tách protein laccase ngoại bào trên gel polyacrylamide 12% kết hợp thực hiện phản ứng enzyme cơ chất ABTS. Kết quả thể hiện qua hình 3.16 cho thấy laccase có khối lượng phân tử khoảng 80 kDa thấp hơn khối lượng laccase từ chủng Trametes versicolor là 97 kDa.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1. Kết luận
- Từ 10 mẫu mùn cưa và nước thải phân lập và tuyển chọn được 1 chủng nấm Trametes
polyzona HUIBF21 có khả năng sinh tổng hợp laccase.
- Chủng T.polyzona HUIBF21 cho sinh khối và hoạt độ enzyme tăng nhẹ trong những ngày đầu, tăng mạnh từ ngày thứ 6 và cao nhất tại ngày thứ 12 (190,92 mg và 434,03 U/mL). Qua ngày thứ 15, chủng T.polyzona HUIBF21 bắt đầu giảm về sinh khối và hoạt độ enzyme (183,09 mg và 419,07 U/mL)
- Laccase chủng T.polyzona HUIBF21 có pH và nhiệt độ tối ưu là 3,5 và 50°C. Ion Cu2+ tăng hoạt tính enzyme trong khi ion Fe3+ ức chế sự hoạt động của laccase. Giá trị Km và Vmax của enzyme lần lượt là 7 mM và 5000 µM/phút. Hiệu suất khử màu thuốc nhuộm tổng hợp của enzyme sau 24 giờ tốt nhất với thuốc nhuộm Crystal Violet (75,20%), thấp nhất với Methylin Blue (9,21%) .
- Gen laccase của T.polyzona HUIBF21 có khối lượng khoảng 80 kDa
2. Kiến nghị
- Nghiên cứu tối ưu sản xuất laccase của chủng T.polyzona ở quy mô phòng thí nghiệm để tăng lượng enzyme thu nhận phục vụ cho các mục đích ứng dụng khác.
- Thử nghiệm nhiều ứng dụng laccase từ chủng T.polyzona HUIBF21 trong điều kiện phòng thí nghiệm và ứng dụng thực tiễn như khử độc do kháng sinh,…
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Bar, M., 2001. Kinetics and physico-chemical properties of white-rot fungal laccases (PhD Thesis). University of the Free State.
Bollag, J.-M., Leonowicz, A., 1984. Comparative studies of extracellular fungal laccases. Applied and environmental microbiology 48, 849–854.
Bourbonnais, R., Paice, M.G., Reid, I.D., Lanthier, P., Yaguchi, M., 1995. Lignin oxidation by laccase isozymes from Trametes versicolor and role of the mediator 2, 2’-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate) in kraft lignin depolymerization. Applied and Environmental Microbiology 61, 1876–1880.
Bulter, T., Alcalde, M., Sieber, V., Meinhold, P., Schlachtbauer, C., Arnold, F.H., 2003. Functional expression of a fungal laccase in Saccharomyces cerevisiae by directed evolution. Applied and environmental microbiology 69, 987–995.
Cavallazzi, J.R.P., Kasuya, C.M., Soares, M.A., 2005. Screening of inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium. Brazilian Journal of Microbiology 36, 383–387.
Crowe, J.D., Olsson, S., 2001. Induction of laccase activity in Rhizoctonia solani by antagonistic Pseudomonas fluorescens strains and a range of chemical treatments. Applied and Environmental Microbiology 67, 2088–2094.
Dũng, N.L., Quyến, N. \DJình, Ty, P.V., 2000. Giáo trình Vi sinh vật học.
Galhaup, C., Goller, S., Peterbauer, C.K., Strauss, J., Haltrich, D., 2002. Characterization of the major laccase isoenzyme from Trametes pubescens and regulation of its synthesis by metal ionsaaThe GenBank accession numbers for the lap2 and lap1a genes reported in this paper are AF414807 and AF414808, respectively.
Microbiology 148, 2159–2169.
Han, M.-J., Choi, H.-T., Song, H.-G., 2005. Purification and characterization of laccase from the white rot fungus Trametes versicolor. Journal of Microbiology 43, 555–560. Heinzkill, M., Bech, L., Halkier, T., Schneider, P., Anke, T., 1998. Characterization of
laccases and peroxidases from wood-rotting fungi (family Coprinaceae). Applied and Environmental Microbiology 64, 1601–1606.
Hullo, M.-F., Moszer, I., Danchin, A., Martin-Verstraete, I., 2001. CotA of Bacillus subtilis
is a copper-dependent laccase. Journal of bacteriology 183, 5426–5430.
Huy, N.D., Ha, D.T.T., Khoo, K.S., Lan, P.T.N., Quang, H.T., Loc, N.H., Park, S.-M., Veeramuthu, A., Show, P.L., 2020. Synthetic dyes removal by Fusarium oxysporum
HUIB02 and stimulation effect on laccase accumulation. Environmental Technology & Innovation 19, 101027.
Iimura, Y., Takenouchi, K., Nakamura, M., Kawai, S., Katayama, Y., Morohoshi, N., 1992. Cloning and sequence analysis of laccase genes and its use for an expression