CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3.Khảo sát một số đặc điểm và động học enzyme ngoại bào
3.3.1. Môt số đặc điểm enzyme từ chủng nấm T.polyzona HUIBF21
a. Ảnh hưởng của pH
Độ pH có ảnh hưởng rất lớn đến vận tốc phản ứng của enzyme. Bởi pH ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa các gốc R của các gốc axit amin trong phân tử enzyme, ion hóa các nhóm chức trong trung tâm hoạt động và ion hóa cơ chất. Để tìm ra khoảng pH tối ưu cho hoạt động của laccase từ chủng T.polyzona HUIBF21, hoạt độ enzyme đã được xác định thông qua việc sử dụng dịch enzyme và các đệm có pH khác nhau từ pH 2,5 đến pH 9. Hoạt tính laccase được thể hiện thơng qua mức độ xanh đậm hay nhạt của sản phẩm tạo thành do cơ chất ABTS bị oxy hóa được thể hiện qua sơ đồ sau (hình 3.10).
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH lên enzyme.
Qua hình 3.10 ta thấy, khi pH tăng từ 2,5 đến 3, hoạt độ enzyme cũng tăng từ 42,3% (171,02 U/mL ± 10,15) đến 84,1% (339,95 U/mL ± 12,34). Laccase do T.polyzona HUIBF21 sinh tổng hợp có hoạt động xúc tác phản ứng mạnh nhất ở pH 3,5, tại đây hoạt độ laccase đo được là 404,21 U/mL ± 3,32 với hiệu suất 100%. Từ ngưỡng pH 3,5 đến 6,5, hoạt động của enzyme giảm mạnh còn 9,83% (39,72 U/mL ± 7,34). Từ ngưỡng pH 7 đến 9, laccase gần như
bị bất hoạt. Vì vậy có thể khẳng định laccase của chủng T.polyzona HUIBF21 sinh tổng hợp có hoạt động xúc tác phản ứng mạnh nhất trong khoảng pH acid từ 3,5 đến 5 tương đương so với một số chủng nấm sinh laccase khác như Trametes trogii, Trametes versicolor, Melacarpus albomyces, Marasmius quercophilus…có pH hoạt động tối ưu của các chủng nói
trên lần lượt là pH 2; 3; 3,5 và 4,5 (Bar, 2001). b. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên dưới ảnh hưởng của nhiệt độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hưởng tới hoạt độ, mức độ ảnh hưởng tùy thuộc vào nhiệt độ và thời gian ủ enzyme. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của laccase được xác định qua việc đo hoạt độ enzyme ở các nhiệt độ phản ứng khác nhau từ 20°C đến 70°C. Kết quả thu được như sau (hình 3.11)
Hình 3.11. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên enzyme.
Kết quả từ hình 3.11 cho thấy khi nhiệt độ tăng dần từ 20°C đến 45°C hoạt độ laccase cũng tăng dần từ 63,61% (291.39 U/mL ± 10.47) đến 94,4% (432,59 U/mL ± 35.8) , nhiệt độ thích hợp nhất cho laccase hoạt động là vào khoảng 50°C, hoạt độ enzyme xác định được lên tới 100% với 458,102 U/mL ± 12.25. Ở ngưỡng 55°C, phản ứng của enzyme bắt đầu giảm chỉ còn khoảng 89,07% (408 U/mL ± 33.7) so với nhiệt độ tối ưu 50°C. Và khi tăng nhiệt độ lên tới 70°C, phản ứng enzyme – cơ chất giảm chỉ còn 63,48% (290.79 U/mL ± 25.8). Như vậy nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của laccase nấm T.polyzona HUIBF21 tương tự chủng
như Pycnoporus sanguineus là 55ºC và 3 loại laccase của Coprinellus micaceus là pool 1,
pool 2, pool 3 tương ứng là 65°C, 60°C, 65°C (Niladevi and Prema, 2005). c. Ảnh hưởng của ion kim loại và phi kim
Sự có mặt của ion kim loại đã ảnh hưởng đến enzyme theo nhiều cơ chế khác nhau, nó có thể làm tăng hay giảm khả năng xúc tác của enzyme. Ngoài ra, các ion kim loại đóng vai trị quan trọng trong việc định hình cấu trúc không gian của phân tử enzyme hoặc trong một vài trường hợp nó là nhân tố cần thiết trong trung tâm hoạt động của enzyme. Do đó ion kim loại có ảnh hưởng lớn tới khả năng hoạt động của enzyme. Chính vì vậy việc xác định ảnh hưởng ion kim loại là một trong những cơ sở định hướng sản xuất enzyme ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Sau 1 giờ ủ 50 µL dịch enzyme cùng các ion kim loại khác nhau: Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, Cu2+, Cl-, I- nồng độ 1mM ở 50°C, hoạt độ của enzyme được xác định ở hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của ion kim loại và phi kim.
Khảo sát ảnh hưởng của các ion kim loại lên hoạt tính laccase cho thấy rằng hoạt tính của enzyme đã được tăng cường với sự hiện diện của các kim loại Cu2+, Zn2+, Mn2+, Ca2+ và Mg2+ ở nồng độ 1 mM (hình 3.12). Trong đó, ion Cu2+ tăng cường mạnh mẽ hoạt động của enzyme, làm tăng hoạt tính tương đối lên đến 100%. Như vậy Cu2+ có thể đóng vai trị nhờ cofactor của enzyme, tham gia vào hoạt động xúc tác tại trung tâm hoạt động của enzyme.
Sự hiện diện của Mn2+, Ca2+ và Zn2+ ảnh hưởng tương đối đến các hoạt tính enzyme dưới 80%. Những điều này cho phép suy luận rất có thể chúng liên kết tương đối yếu với trung tâm hoạt động enzyme laccase. Ngoài ra, hoạt động của laccase được kích thích bởi ion Mg2+, có thể do sự pha trộn của ion Mg2+ là cần thiết cho các vị trí xúc tác và cấu trúc protein. Theo đó, sự hiện diện của ion Mg2+ làm thay đổi cấu trúc bậc 2 của protein và làm hoạt tính enzyme tăng.
Với các ion phi kim Cl- và I- có tác dụng ức chế nhẹ hoạt động của enzyme này, hoạt độ thu được còn lại sau khi xử lý còn lại dưới 20%.
Đồng thời, khác với các enzyme khác, laccase có cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tử đồng. Tuy nhiên, hoạt tính laccase đã hồn tồn bị ức chế bởi việc bổ sung ion Fe3+. Chứng tỏ ion Fe3+ có khả năng khơng liên kết với trung tâm hoạt động enzyme. Điều này có thể giải thích là do sự tương tác của ion Fe3+ với nhóm S - S hoặc –SH của laccase hình thành phức hợp laccase - Fe, làm thay đổi cấu hình và giảm hoạt động của enzyme.
3.3.2. Động học enzyme
Giá trị Km và Vmax đặc trưng cho tính đặc hiệu của mỗi loại enzym đối với mỗi loại cơ chất. Hằng số Km của phản ứng enzyme được xác định bởi dải nồng độ ABTS từ 1 đến 10 mM/mL. Dựa vào sản phẩm tạo thành của phản ứng giữa enzyme với cơ chất ở các nồng độ khác nhau chúng tôi đã xây dựng đồ thị phụ thuộc của tốc độ phản ứng vào nồng độ cơ chất ABTS theo phương pháp của Linewever-Burk (hình 3.13) và các thông số động học Km, Vmax được xác định.
Kết quả cho thấy, phương trình phụ thuộc giữa tốc độ phản ứng với nồng độ cơ chất ABTS đã tuân theo hàm y = 0.0014x + 0.0002 với độ tin cậy 99,83% (R2 = 0.9983). Khi tăng nồng độ cơ chất ABTS từ 1 – 10 mM/mL thì nồng độ sản phẩm tạo thành tăng dần nghĩa là vận tốc phản ứng tăng dần từ 0,00014 µM/phút đến 0,0014 µM/phút. Khi nồng độ cơ chất quá 10 mg/mL thì tốc độ phản ứng khơng tăng, đồ thị đi ngang (hình 3.13). Giá trị Km và Vmax trong thí nghiệm này được tính tương ứng là 7 mM và 5000 µM/phút, thấp hơn so với Km và Vmax laccase của T.versicolor là 12,8 mM và 8125,4 µM/phút (Han et al., 2005).