CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.2. Xây dựng đường cong sinh trưởng và đường cong tích lũy enzyme của chủng nấm
phân lập được
a. Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng nấm phân lập được
Chủng nấm được nuôi cấy lắc trong môi truờng BSM lỏng, ở 30ºC, lắc 180 vịng/phút. Mỗi ngày tiến hành thu tồn bộ dịch ni của 1 bình đem lọc bằng giấy lọc, giữ lại phần sinh khối tế bào rồi sấy khô, xác định trọng lượng khô của chủng nấm trong 15 ngày nuôi (Dũng et al., 2000).
b. Xây dựng đường cong tích lũy enzyme ngoại bào của chủng nấm phân lập
Xây dựng đường cong tích lũy enzyme của chủng nấm phân lập được bằng cách xác định hoạt độ laccase trong 15 ngày với cơ chất ABTS.
Xác định hoạt độ laccase với cơ chất ABTS:
Hoạt độ của laccase được xác định dựa trên việc theo dõi q trình oxy hóa của cơ chất ABTS ở bước sóng 420 nm. Một đơn vị hoạt động của enzyme được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác q trình oxy hóa 1 mM ABTS mỗi phút trong một phản ứng (Tian et al., 2014)
Enzyme được ly tâm 13.000 vòng/phút ở 4°C trong 10 phút, thu dịch nổi enzyme. Cho 50 µL enzyme đã được ủ với 1,6 mM ABTS vào trong 1 mL dung dịch đệm sodium acetat 100 mM, pH 3,6. Phản ứng được tiến hành ở 50°C trong 10 phút. Sau đó đo độ hấp thụ quang ở 420 nm (ε420 = 36,0 mM/cm) bằng máy đo quang phổ (Tian et al., 2014).
Công thức xác định hoạt độ enzyme:
Trong đó:
U : Hoạt độ enzyme (U/L)
A : Giá trị độ hấp thụ ánh sáng đo được Vpu: Tổng thể tích phản ứng (1 mL)
VE : Thể tích enzyme thực hiện phản ứng (0,09 mL) t : Thời gian thực hiện phản ứng (60 phút)
Xây dựng đường cong tích lũy enzyme:
Tiến hành nuôi cấy lắc chủng nấm trong môi truờng sinh tổng hợp laccase BMS bổ sung 10% D-glucose ở 30°C, lắc 180 vịng/phút (Xu et al., 2015). Mỗi 3 ngày ni tiến hành thu enzyme một lần trong 15 ngày. Hút 1 mL dịch nuôi đưa đi ly tâm 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi tách riêng phần dịch và phần sinh khối tế bào. Phần dịch sau ly tâm được thu để tiến hành xác định hoạt tính với cơ chất ABTS và đo OD ở bước sóng 420 nm theo thành phần phản ứng nêu trên, từ đó tính hoạt độ enzyme laccase của chủng nấm (Tian et al., 2014).