CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập, tuyển chọn và định danh chủng nấm sinh tổng hợp laccase
3.1.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase
Từ 10 mẫu mùn cưa và nước thải thu thập từ nhiều địa điểm khác nhau tại thành phố Đà Nẵng và tỉnh Thừa Thiên Huế, sau 5 đến 8 ngày nuôi trong tủ ổn nhiệt ở 30°C trên mơi trường phân lập BSM có bổ sung guaiacol (0.01%), sàng lọc được 1 chủng nấm có vùng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu hồng sang màu nâu đỏ được ký hiệu HUIBF21. Chủng này sau sàng lọc được tiến hành làm thuần trên môi trường PDA, thử lại hoạt tính với cơ chất guaiacol (0.01%) và bảo quản ở -40°C (hình 3.1).
Hình 3.1. Hình ảnh phân lập và tuyển chọn chủng nấm sinh tổng hợp laccase.
(A: Phân lập và sàng lọc chủng nấm từ mẫu mùn cưa; B: Thử hoạt tính laccase từ chủng nấm với cơ chất guaiacol; C: Làm thuần chủng nấm trên môi trường PDA; D: Bảo quản giống)
Kết quả cho thấy, chủng HUIBF21 có khả năng sinh tổng hợp laccase vì enzyme của chủng nấm tổng hợp được có khả năng oxy hóa guaiacol làm xuất hiện các vùng màu hồng đến nâu đỏ xung quanh khuẩn lạc (Viswanath et al., 2008). Do đó chủng này được lựa chọn để tiếp tục định danh và xây dựng sơ đồ phả hệ.
3.1.2. Định danh chủng HUIBF21
Định danh chủng HUIBF21 dựa vào đặc điểm hình thái của chủng nấm phân lập được. Đặc điểm hình thái của chủng nấm có hoạt tính sinh tổng hợp laccase được thể hiện ở hình sau (hình 3.2).
Hình 3.2. Đặc điểm hình thái sợi nấm.
(A: Chủng nấm trên mơi trường PDA; B: Hình thái sợi nấm)
Chủng HUIBF21 có khuẩn lạc phát triển nhanh trên mơi trường PDA ở 30ºC, đạt đường kính 8,5 cm sau 4 ngày ni cấy. Khuẩn lạc có màu trắng. Sợi nấm mọc nhơ cao khỏi bề mặt mơi trường ni cấy (hình 3.2A). Sợi nấm có vách ngăn ngang và phân nhánh. Cuống bào tử được hình thành sau 2 ngày ni cấy. Cuống bào tử mọc trực tiếp từ sợi nấm, có dạng búp măng, trịn ở đầu. Các bào tử được hình thành từ nhiều vị trí trên cành bào tử, có hình bầu dục, trịn ở 2 đầu (hình 3.2B). Theo khóa phân loại của De Hoog Guarro, Gené & Figueras (2000), chi Trametes mơ tả có khuẩn lạc trắng; cuống bào tử được hình thành từ sợi nấm, phân nhánh nhiều, thường mọc thành cụm với hình trụ hoặc có hình búp măng; bào tử thường có hình bầu dục. Căn cứ theo khóa phân loại trên thì chủng HUIBF21 được định danh sơ bộ thuộc chi
Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử
Chủng HUIBF21 làm thuần sẽ được nuôi cấy lỏng trong 200 mL môi trường PDA, pH 5,6 với vận tốc 180 vòng/phút ở 30°C. Toàn bộ sinh khối nấm sẽ được sử dụng để tách chiết DNA tổng số và làm khuôn cho phản ứng PCR nhằm kiểm tra và giải trình tự để định danh và xây dựng sơ đồ phả hệ.
Hình 3.3. Hình ảnh điện di DNA tổng
số chủng HUIBF21.
M: thang phân tử 1 kb chuẩn (Thermo Scientific, Mỹ); 1: HUIBF.21
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS.
M: thang phân tử 1 kb chuẩn (Thermo Scientific, Mỹ); 1: Sản phẩm PCR với khuôn DNA tổng số của chủng HUIBF21. Kết quả trong hình 3.3 cho thấy đã tách thành công DNA tổng số với hàm lượng DNA tương đối. Mặc dù sản phẩm DNA tổng số của chủng HUIBF21 có độ tinh sạch khơng cao và bị đứt gãy nhiều nhưng vẫn có thể sử dụng cho phản ứng PCR ở thí nghiệm tiếp theo.
Từ kết quả điện di quan sát được trên gel agarose ở hình 3.4 cho thấy đối với cặp mồi ITS, sản phẩm PCR cho kết quả là một band DNA với kích thước khoảng 620 bp so với thang tiêu chuẩn.
Kết quả giải trình tự gene của chủng HUIBF2 được thể hiện trong hình 3.5.
Hình 3.5. Trình tự đoạn ITS của chủng HUIBF21.
Các trình tự của băng đoạn ITS chủng HUIBF21 được giải có chiều dài 580 bp. Kết quả BLAST trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene NCBI cho thấy các trình tự ITS của HUIBF21 tương đồng 99,66 % với trình tự ITS của lồi Trametes polyzona BPSM12 (Mã số: KJ865842.1) (hình 3.6).
Hình 3.6. Kết quả BLAST trên cơ sở dữ liệu của ngân hàng gene NCBI.
Kết quả này có thể khẳng định chủng HUIBF21 là loài Trametes polyzona HUIBF21 (T.polyzona HUIBF21).
Từ kết quả giải trình tự trên, xây dựng được sơ đồ phả hệ như sau (hình 3.7).
Hình 3.7. Sơ đồ phả hệ T.polyzona HUIBF21.
Dựa vào sơ đồ phả hệ cho thấy chủng T.polyzona HUIBF21 và chủng Trametes polyzona BPSM12 (Mã số: KJ865842.1) tạo thành một nhóm riêng có mức độ tương đồng cao (99,66%) với chỉ số bootstrap 21%.
Việc phân lập được chủng nấm T.polyzona HUIBF21 là mới và có ý nghĩa. Trên thế giới, tuy có rất nhiều cơng bố về Trametes polyzona nhưng ở Việt Nam thì đây là chủng nấm đầu tiên được tìm thấy có khả năng sinh tổng hợp laccase. Vì thế, nên cần tiến hành nghiên cứu sâu hơn.