1.5.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al. (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ
37oC . Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 μl dịch khuẩn, nồng độ
tương đương 4 – 5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 – 3 cm. Chuẩn bị dịch chiết thử bằng cách hòa tan cặn chiết methanol của các mẫu thực vật trong DMSO thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50 μL dịch chiết thử
tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau
đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng
sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml với E. coli và P. mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S.
aureus và P. vulgaris); đối chứng âm là DMSO.
- Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:
BK = D – d
Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn (mm) d = đường kính lỗ khoan thạch (mm) BK là vòng ức chế vi sinh vật (mm)
- Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.
1.5.4. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độđặc hiệu cao được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Bản chất GC/MS là sự kết hợp của sắc ký khí và khối phổ.
- Nguyên tắc hoạt động:
Nhờ có khí man có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây.
Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào
detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện.
Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu dược xử
lý ởđó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu sử dụng để chiết dịch chiết trong nghiên cứu này là: lá ổi non tại xã Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
Hình 2.1. Lá ổi non 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất a) Dụng cụ - thiết bị Bảng 2.1. Bảng dụng cụ Dụng cụ Số lượng Dụng cụ Số lượng Bộ soxhlet 1 Nhiệt kế 1 Bình cầu 1, 2 cổ (500ml) 2 Cốc thủy tinh (500ml, 250ml,100ml) 8 Đĩa petri 18 Ống nghiệm ( 18) 10
Cốc sứ 2 Phễu chiết (250ml) 3
Que cấy đầu nhọn 3 Bóp cao su 1
Đèn cồn 1 Erlen (100ml, 250ml) 6
Bình tia 1 Đũa thủy tinh 1
Pipet (10ml, 5ml,
2ml, 1ml) 5 Ống đong (500ml,
250ml) 2
Giá đỡ ống nghiệm 1 Que cấy đầu tròn 1
Bảng 2.2. Bảng thiết bị
Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng
Máy đo UV – VIS 1 Bếp điện bình cầu 1
Máy cô quay chân không 1 Máy sắc khí phổ GC/MS 1
Cân phân tích (0.0001g) 1 Tủ sấy 1
Lò nung 1 Nồi hấp khử trùng 1
Máy xay 1 Máy đo pH 1
Máy ly tâm 1
b) Hóa chất
- Cồn 96o
- Dimethyl sulfoxit (DMSO)
- Dung dịch Folin - Ciocalteu - TSB - Ampicillin - BaCl2 - Na2CO3 10% - FeCl3 5% - Acid gallic - Agar - Tetracylin - MHA - MHB - MP - H2SO4 - Amonia 2.1.3. Vi khuẩn thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại trường Đại Học Công Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. Chủng Staphylococcus aureus Chủng Escherichia coli Chủng Salmonella spp Chủng Bacilus cereus Chủng Pseudomonas aeruginosa
2.1.4. Các phương pháp nghiên cứu [3]
- Nghiên cứu lý thuyết: nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan các tài liệu vềđặc
điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng của lá ổi non. - Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
Nghiên cứu chiết tách dịch chiếtbằng phương pháp soxhlet với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết.
Nghiên cứu phương pháp trọng lượng: xác định độ ẩm, hàm lượng tro của lá ổi
Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong cao chiếtlá ổi non bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS.
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
2.2. Xử lý nguyên liệu
Cây ổi lấy toàn bộ lá vừa và non. Chọn những lá tươi, không bị sâu bệnh, nấm mốc.
Đem đi rửa sạch phần bị bẩn, sấy ở nhiệt độ 60oC tới cho đến khi mẫu khô giòn, có khối lượng không đổi.
Hình 2.2. Lá ổi sấy khô và sau khi được xay nhỏ 0.5 – 1cm 2.3. Đề xuất quy trình chiết cao từ lá ổi non 2.3. Đề xuất quy trình chiết cao từ lá ổi non
Sơ đồ 2.1. Quy trình đề xuất chiết cao từ lá ổi non 2.3.2. Thuyết minh quy trình 2.3.2. Thuyết minh quy trình
- Bước 1: Lá ổi (vừa và non) sau khi được thu hái loại bỏ những lá sâu, đem đi rửa sạch loại bỏ bẩn, rồi sấy ở nhiệt độ 60oC tới nhiệt độkhông đổi. Xay nhỏ 0.5 – 1 cm rồi cân chính xác 10 g (± 0,1 g). Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).
- Bước 2: Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm). Đong
250 ml cồn 96 cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống chiết soxhlet. Đun nguyên liệu trong 120 phút , ở nhiệt độ 78oC.
- Bước 3: Dịch trích sau đó được lọc, cô quay đuổi dung môi hoàn toàn, thu được cao. Cao lá ổi non được bảo quản trong lọ thủy tinh đậy kín ở 4oC, tránh ánh sáng.
- Bước 4: Đem cao chiết đi phân tích GC/MS để xác định thành phần hóa học và thử
hoạt tính sinh học trên khuẩn E.Coli, Bacilus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp và Pseudomonas aeruginosa.
Chiết bằng phương pháp
soxhlet
Cao chiết thô
Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tối ưu:
1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 và 1:50 g/ml Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro Khảo sát yếu tốảnh hưởng đến quá trình chiết: nhiệt độ Xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC/MS Nguyên liệu Thử hoạt tính kháng khuẩn Cô quay Dịch chiết Xử lý Sấy khô, xay nhỏ
Khảo sát thời gian chiết tối ưu: 60 phút, 90
phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút
2.4. Đề xuất mô hình chưng cất thực nghiệm tại phòng thí nghiệm
Hình 2.3. Mô hình chiết cao lá ổi non tại phòng thí nghiệm 2.5. Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý [1] 2.5. Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý [1]
2.5.1. Xác định độ ẩm
- Chuẩn bị 3 chén sứ đã đánh số, rửa sạch, tráng lại bằng nước cất, sấy khô đến khối lượng không đổi. Sau đó, cân lấy trọng lượng m1 (g).
- Cân khoảng 3g lá ổi non (đã được xử lý) cho vào chén sứ đã chuẩn bị sẵn ta có m2 (g).
- Đem sấy ở nhiệt độ 100oC, cứ sau 2h lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội rồi cân, làm như vậy cho đến khi khối lượng mẫu và chén sứ xem như không đổi kết quả m3 (g).
- Công thức tính độ ẩm:
Độẩm của mỗi mẫu:
(%) = (𝑚1+ 𝑚2)− 𝑚3
Độẩm trung bình:
TB(%) = ∑𝑛1(%) 𝑛
Trong đó: m1: trọnglượng chén sứ (g)
m2: trọnglượng lá ổi non (g)
m3: trọng lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g) n: số lần xác định (%).
2.5.2.Xác định hàm lượng trobằng phương pháp tro hóa mẫu
- Các mẫu lá ổi non (m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để hóa tro. Các mẫu được cho vào lò nung và tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 600oC trong thời gian từ 6h, cho đến khi thu được tro màu xám trắng. Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng
m4.
- Công thức tính hàm lượng tro:
Hàm lượng tro của mỗi mẫu:
% tro = 𝑚4− 𝑚1
𝑚2 x 100%
Hàm lượng tro trung bình:
% tro trung bình = ∑ 𝑡𝑟𝑜𝑛1 𝑛
Trong đó: m1: khối lượng chén sứ (g)
m2: khối lượng lá ổi non ban đầu (g)
m3: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hóa (g)
n: số lần xác định % tro
2.6. Khảo sát điều kiện chiết
- Khi nghiên cứu về chiết tách dịch chiết từ lá ổi non bằng phương pháp chiết soxhlet, các yếu tố đầu tiên cần phải nghiên cứu là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết. Đó là các yếu tốảnh hưởng trực tiếp đến lượng dịch chiết thu được.
Bảng 2.3. Bảng khảo sát điều kiện chiết STT Tên thông số Giá trị thông số STT Tên thông số Giá trị thông số
1 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 và 1:50 g/ml 2 Thời gian chiết 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút
- Khối lượng lá ổi non khô cho mỗi lần thí nghiệm là 10 g. Các thông số khảo sát sơ
bộ là tiền đề quan trọng để tìm các thông số thích hợp. Kết quả nghiên cứu được trình
bày như sau:
2.6.1.Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi a) Mục đích a) Mục đích
- Tỷ lệ dung môi là tỷ lệ (khối lượng nguyên liệu khô/thể tích dung môi) cần thiết và hợp lý đủđể dung môi thẩm thấu vào nguyên liệu. Nghiên cứu tỷ lệdung môi để xem xét ở tỷ lệ dung môi nào thì dịch chiết khuếch tán tốt nhất và đạt tỷ lệ cao nhất. - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu dịch chiết. Lượng
dung môi quá nhiều thì dịch chiết thu được sẽ bị pha loãng, lẫn nhiều tạp chất. Thể
tích dung môi quá ít thì không chiết kiệt được hoạt chất có trong nguyên liệu.
b) Cách tiến hành
- Chuẩn bị 7 mẫu, mỗi mẫu cân khoảng 10 g lá ổi non (đã được xử lý), cho vào túi lọc, tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 78oC trong 4 giờ với các thể tích cồn tuyệt đối khác nhau 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml và 500 ml.
- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao. Rồi đem đi cân lấy khối lượng Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu.
2.6.2. Khảo sát thời gian chiếta) Mục đích a) Mục đích
- Thời gian chiết càng lâu lượng dịch thu được càng nhiều. Tuy nhiên, đến một thời
điểm nào đó thì lượng dịch thu được không tăng mặc dù thời gian ta kéo dài thêm. - Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết do
nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên của cao sau khi cô quay, đồng thời năng lượng tiêu tốn nhiều dẫn đến chi phí sản xuất tăng, không có hiệu quả về
kinh tế.
b) Cách tiến hành
- Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10g lá ổi non (đã được xử lý) với khoảng 250ml cồn tuyệt đối rồi tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 78oC với các thời gian khác nhau 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút.
- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao. Rồi đem đi cân lấy khối lượng Thời gian chiết tối ưu.
2.7. Khảo sát yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến dịch chiết lá ổi [2]
- Lấy các mẫu dịch chiết bằng dung môi cồn tuyệt đối bảo quản trong các điều kiện khác nhau là vừa mới chiết, để ở nhiệt độ phòng, để trong tủ lạnh.
- Sau 5 ngày lấy ra quan sát.
2.8. Tính hiệu suất chiết xuất cao thô
Cao lá ổi non sau khi cô quay được tính hiệu suất theo công thức sau: %H = mcao
mnguyên liệu x 100
Trong đó: %H là hiệu suất cao thô (%)
mcao là khối lượng cao thu được (g)
mnguyên liệu là khối lượng lá ổi non được dùng để chiết (g)
2.9. Định tính Flavonoid [3], [5]
- Trong thành phần hóa học của lá ổi thì Flavonoid là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đang được quan tâm. Vì vậy có các phản ứng đặc trưng: tạo dụng dịch màu xanh lục đen khi tác dụng với FeCl3 5 %, vết Flavonoid có màu vàng khi tiếp xúc với hơi
amoniac.
Dung dịch FeCl3 5 %: lấy khoảng 10 ml dịch chiết cho vào 2 ống nghiệm.
Ống 1: để đối chứng.
Ống 2: thêm vài giọt FeCl3 5 %
Để yên, quan sát và nhận xét.
Hơi amoniac: lấy khoảng 10 ml amoniac cho vào ống nghiệm, tẩm vài giọt dung dịch chiết lá ổi non lên tờ giấy lọc, hơ giấy lọc trên miệng ống nghiệm. Quan sát và nhận xét.
2.10. Xác định thành phần hóa học trong caolá ổi non bằng phương pháp GC/MS
Dịch chiết lá ổi non được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được chất rắn dạng cao. Gửi mẫu cao đến Chi cục Kiểm Định Hải Quan 4 tại số 10, đường Ngô Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.
2.11. Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [9] khuẩn [9]
2.11.1.Chuẩn độ đục
Sử dụng thang độ đục chuẩn MacFarland 0,5 được chế bằng cách sau: lấy 0,5 ml BaCl2 0,48 M trộn đều với 99,5 ml H2SO4 0,35 M đồng thời khuấy liên tục để tạo
huyền dịch. Chia thành các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn độ vi sinh vật, mỗi
ống 4 – 6 ml huyền dịch, đậy nút. Đểở chỗ tối trong tủ lạnh và có thể sử dụng được
trong vòng 6 tháng. Độđục này tương ứng với 108 CFU/ml.
2.11.2.Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm
Giống trước khi sử dụng được tăng sinhtrên môi trường TSB trong 12 giờở 37oC, ly
tâm tốc độ quay 4000 vòng trong 5 phút. Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm
tách sinh khối và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độđục tương đương 0,5 MC Farland.
2.11.3.Chuẩn bị nồng độ chất thử
- Cân 1.6 g cao cho vào 1 ml DMSO 5% được dung dịch gốc. Dung môi DMSO được
tiệt trùng, khi sử dụng pha loãng thành dung môi thử nghiệm thành các nồng độ trong
môi trường thử nghiệm như sau: 1600 mg/ml, 800 mg/ml, 400 mg/ml và 200 mg/ml. - Kháng sinh đối chứng dương gồm ampicillin và tetracylin. Mẫu đối chứng âm là dung
dịch DMSO 5%.
2.11.4.Tiến hành thí nghiệm
Cho vào mỗi đĩa petri 25 ml môi trường MHA vô trùng (khoảng 50 – 60oC) để yên cho môi trường đông đặc, thêm 100 µl dịch vi khuẩn mật độ 1,5 x 108 CFU/ml. Mỗi
đĩa petri được đặt 1 đĩa kháng sinh chứng dương và 6 đĩa giấy trắng đường kính 6mm
vô trùng. Cho vào 5 đĩa trắng lần lượt 1 l dịch chiết đã phavà 1 đĩa còn lại 1 l dung dịch DMSO 5 % làm chứng âm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các đĩa ở 32oC trong 16 – 20 giờ. Đường kính vòng ức chếđược đo bằng thước đo đơn vị mm.
2.11.5.Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn
Đường kính vòng vô khuẩn (D –d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài