Các phương pháp kỹ thuật

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

1.5. Các phương pháp kỹ thuật

- Phương pháp phân tích khối lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hay ở dạng đơn chất có trong mẫu cần phân tích.

- Nguyên tắc:

 Chất cần phân tích được tách ra khỏi mẫu ở dạng hợp chất kết tủa

 Kết tủa được lọc, rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi để chuyển thành dạng có công thức hóa học xác định (gọi là dạng cân)

 Cân chính xác khối lượng dạng cân, dùng khối lượng và công thức hóa của dạng

cân đểtính hàm lượng chất cần phân tích

Hình 1.12. Cân phân tích

 Có độ chính xác cao (0.01%)

 Đơn giản về nguyên tắc, dụng cụphân tích thông thường

 Độđúng và độ lặp lại tốt (nếu làm cẩn thận)

- Nhược điểm: Tốn kém thời gian do phải trải qua nhiều giai đoạn

1.5.2. Một số phương pháp chiết

- Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Thường gặp chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ.

- Mục đích: định tính, định lượng và xác định cấu trúc - Phân loại:

 Chiết lỏng – lỏng

 Chiết lỏng – rắn

a) Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm

- Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phân tử trong không gian, có tần số lớn hơn giới hạn ngưỡng nghe của con người (16 – 20KHz). - Siêu âm làm dung môi bị sủi bọt, đẩy tạp chất ra khỏi bề mặt mẫu. Bản chất sóng siêu

âm khác với sóng điện từ.

- Nguyên tắc: dưới tác dụng của siêu âm làm cho dung môi tại các hốc nhỏ (ví dụ:

dược liệu) bị sủi bọt, đấỷ chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào dung môi (chiết xuất).

- Ưu điểm:

 Thiết bịtương đối đơn giản, bảo quản và vận hành dễdàng, không quá đắt tiền.

 Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi khá đa dạng.

 Lượng mẫu: có thểlên đến hàng trăm gam.

 Giảm được nhiệt độ và áp suất  áp dụng để chiết cho các hoạt động chất không bền với nhiệt.

 Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết làm tiết kiệm năng lượng đầu vào.

- Nhược điểm:

 Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly.

 Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một

lượng dịch chiết hoặc chiết chiết có thể bị nhiễm bẩn.

 Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽảnh hưởng đến hiệu suất chiết.

b) Phương pháp ngâm

- Là phương pháp cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu lấy dịch chiết. Tùy theo nhiệt độ chiết xuất, chia thành:

 Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với những dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt.

 Hãm: cho dung môi vào dược liệu đã chia nhỏ trong một thời gian xác định, có thể khuấy trộn, thường dung cho hợp chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao.

 Hầm: ngâm dược liệu đã chia nhỏ với dung môi trong một bình kín, giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định, thỉnh thoảng có khuấy trộn, thường áp dụng với những chất ít tan ở nhiệt độ thường, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao.

 Sắc: đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong một thời gian nhất định

- Tùy theo số lần ngâm chia thành:

 Ngâm một lần với toàn bộ dung môi

 Ngâm nhiều lần với từng phân đoạn dung môi

- Ưu điểm:Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền.

- Nhược điểm:

 Năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu).

 Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu.

 Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.

c) Phương pháp chiết soxhlet

- Tiến hành: dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu. Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông bình cầu cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu. Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt.

- Ưu điểm:

 Quá trình chiết xuất liên tục

 Tốn ít dung môi hơn các phương pháp trên

- Nhược điểm:

 Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy.

 Không thực hiện liên tục được sự khuấy trộn

Hình 1.13. Mô hình soxhlet

1.5.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch

- Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al. (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ

37oC . Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 μl dịch khuẩn, nồng độ

tương đương 4 – 5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 – 3 cm. Chuẩn bị dịch chiết thử bằng cách hòa tan cặn chiết methanol của các mẫu thực vật trong DMSO thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50 μL dịch chiết thử

tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau

đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng

sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml với E. coli và P. mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S.

aureus và P. vulgaris); đối chứng âm là DMSO.

- Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:

BK = D – d

Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn (mm) d = đường kính lỗ khoan thạch (mm) BK là vòng ức chế vi sinh vật (mm)

- Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.

1.5.4. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)

- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độđặc hiệu cao được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Bản chất GC/MS là sự kết hợp của sắc ký khí và khối phổ.

- Nguyên tắc hoạt động:

 Nhờ có khí man có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây.

 Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào

detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện.

 Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu dược xử

lý ởđó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM