1. Nguyễn Vân Anh. “So sánh hoạt tính kháng khuẩn của lá 4 nhóm ổi ruột đỏ (Psidium Guajava L.)”. Cần Thơ –năm 2012.
- Bốn nhóm Ổi Ruột Đỏ (Psidium gaujava) được trồng cùng điều kiện (nhiệt độ, ánh
sáng, dinh dưỡng,…) được tiến hành chiết xuất với methanol bằng phương pháp ngâm để thu được cao ổi.
- Kết quả:
Cao lá 4 nhóm ORD có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên tất cả chủng vi khuẩn thử
nghiệm và mạnh nhất trên vi khuẩn Staphylococcus aureus (32 µg/ml ≤ MIC ≤ 128 µg/ml), đây là vi khuẩn gây bệnh phổ biến trên gia súc gia cầm và con người,
có khảnăng đề kháng cao với các kháng sinh nhóm -lactams và là nguyên nhân
gây viêm vú ở bò sữa, viêm da có mủ ở chó (Nguyễn Như Thanh và ctv, 1997;
Lưu Hữu Mãnh, 2009).
Cao lá ORD cũng có hoạt tính kháng khuẩn tốt trên P. aeruginosa (MIC =
512 µg/ml), đây là vi khuẩn có khả năng mạnh với cefoperazone và nhóm
aminoglycoside (Hoàng Kim Tuyến và ctv, 2005), và là nguyên nhân gây bệnh cho
nhiều loài vật như: viêm teo mũi, viêm tử cung ở bò, chứng chảy nước mũi ở tai chó mèo, nhiễm trùng máu ở gà (Carter, 1978).
2. Nguyễn Thành Lộc. “Báo cáo nghiên cứu dược liệu cây ổi (Psidium Guajava L.)”. Cần Thơ –năm 2018.
- Kết quả: Vềđịnh tính: đã chỉra được nhiều thành phần có trong có trong dược liệu
ổi như: tinh dầu, flavonoid, tannin, chất béo,… Ngoài ra sau khi khảo sát hệ dung môi khác nhau với nhiều tỉ lệ khác nhau thì nhận thấy rằng hệ dung môi: chloroform –
ethyl acetat –acid formic (5:5:1) cho được vết tách rõ và đẹp nhất khi chấm sắc ký.
3. Nguyễn Thị Ngọc Lan. “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học các hợp chất trong lá ổi non (Psidium Guajava L)”.
- Tiến hành ngâm lá ổi non trong các dung môi khác nhau n-hexan, chloroform, etylaxetat, cồn tuyệt đối trong 3 ngày. Sau đó pha loãng đem đo UV – VIS để xác
định dung môi tối ưu.
- Kết quả: Bằng cảm quan thì thấy dịch chiết trong dung môi cồn tuyệt đối cho màu xanh đậm và theo kết quả đo UV-VIS ở bảng 1.2 thì mật độ quang của dịch chiết trong dung môi cồn tuyệt đối là lớn nhất. Do đó cồn tuyệt đối là dung môi tối ưu để
Bảng 1.2. Màu sắc và mật độ quang của các dịch chiết ngâm trong các dung môi khác nhau
STT Tên dung môi Màu sắc Mật độ quang
1 n-hexan Vàng nhạt 0.1814 2 Chloroform Vàng xanh 0.3046 3 Etyl acetat Xanh nhạt 2.5914
4 Cồn tuyệt đối Xanh đậm 2.6128 1.4.2. Bài báo nghiên cứu khoa học ngoài nước [13],[14]
1. “Antimicrobial Activities of Leaf Extracts of Guava (Psidium guajava L) on Two Gram-Negative and Gram-Positive Bacteria”, International Journal of Microbiology Volume 2013.
- Kết quả:
Chứng minh tiềm năng kháng khuẩn của chiết xuất lá Psidium guajava bằng cách sử dụng các dung môi khác nhau. Kết quả chỉ ra rằng ethanol và metanol tốt hơn
n-hexane và nước để chiết xuất các đặc tính kháng khuẩn của lá ổi.
Cũng chỉ ra rằng chất chiết xuất từ lá ổi không có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram âm, cho thấy chúng không chứa các hoạt chất chống lại các sinh vật. Sự ức chế quan sát được của vi khuẩn gram dương, Bacillus cereus và Staphylococcus aureus, cho thấy rằng ổi có các hợp chất chứa các đặc tính kháng khuẩn có thểngăn chặn sựtăng trưởng khi chiết xuất bằng cách sử dụng metanol hoặc ethanol làm dung môi.
2. “Chemical Components and Bioactivities of Psidium guajava”, International Journal of Food Nutrition and Safety, 2014.
- Cây Psidium guajavađã thu hút sự chú ý cho chất chống oxy hóa của nó tiềm năng. Khảnăng chống oxy hóa của chiết xuất quảổi đã được đánh giá bằng các xét nghiệm
chống oxy hóa in vitro khác nhau (ABTS, DPPH và FRAP) (Martinez và cộng sự,
2012)
- Kết quả:
Psidium guajava chiết xuất từ vỏ trái cây có khảnăng làm giảm căng thẳng oxy hóa của tuyến tụy ở chuột bị tiểu đường streptozotocin gây ra (45 mg/kg). Kết quả
cho thấy dịch chiết nước Bổ sung vỏ trái cây Psidium guajava có thể làm giảm malondialdehyd (MDA) và protein carbonyl mức độ và hoạt động của mức độ
superoxide effutase (SOD) và glutathione (GSH) cao hơn (Budin et al., 2013).
Tác dụng hạđường huyết của ổi cũng liên quan đến khảnăng chống oxy hóa của nó hoạt động (Huang và cộng sự, 2011). Bổ sung ổi hồng có thể làm giảm peroxid
hóa lipid và tăng hoạt động của enzyme chống oxy hóa như catalase, superoxide
effutase, glutathione peroxidase và glutathione reductase trong máu chuột tăng
huyết áp tự phát (Nor và Yatim, 2011).
1.5. Các phương pháp kỹ thuật [3],[4]1.5.1. Phương pháp phân tích khối lượng 1.5.1. Phương pháp phân tích khối lượng
- Phương pháp phân tích khối lượng là phương pháp phân tích định lượng dựa vào kết quả cân của khối lượng một chất tinh khiết hay ở dạng đơn chất có trong mẫu cần phân tích.
- Nguyên tắc:
Chất cần phân tích được tách ra khỏi mẫu ở dạng hợp chất kết tủa
Kết tủa được lọc, rửa sạch, sấy khô đến khối lượng không đổi để chuyển thành dạng có công thức hóa học xác định (gọi là dạng cân)
Cân chính xác khối lượng dạng cân, dùng khối lượng và công thức hóa của dạng
cân đểtính hàm lượng chất cần phân tích
Hình 1.12. Cân phân tích
Có độ chính xác cao (0.01%)
Đơn giản về nguyên tắc, dụng cụphân tích thông thường
Độđúng và độ lặp lại tốt (nếu làm cẩn thận)
- Nhược điểm: Tốn kém thời gian do phải trải qua nhiều giai đoạn
1.5.2. Một số phương pháp chiết
- Chiết là phương pháp dùng một dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách một chất hay một nhóm các chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu. Thường gặp chiết hoạt chất từ dung dịch nước vào dung môi hữu cơ.
- Mục đích: định tính, định lượng và xác định cấu trúc - Phân loại:
Chiết lỏng – lỏng
Chiết lỏng – rắn
a) Phương pháp chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm
- Siêu âm là sóng cơ học hình thành do sự lan truyền dao động của các phân tử trong không gian, có tần số lớn hơn giới hạn ngưỡng nghe của con người (16 – 20KHz). - Siêu âm làm dung môi bị sủi bọt, đẩy tạp chất ra khỏi bề mặt mẫu. Bản chất sóng siêu
âm khác với sóng điện từ.
- Nguyên tắc: dưới tác dụng của siêu âm làm cho dung môi tại các hốc nhỏ (ví dụ:
dược liệu) bị sủi bọt, đấỷ chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào dung môi (chiết xuất).
- Ưu điểm:
Thiết bịtương đối đơn giản, bảo quản và vận hành dễdàng, không quá đắt tiền.
Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi khá đa dạng.
Lượng mẫu: có thểlên đến hàng trăm gam.
Giảm được nhiệt độ và áp suất áp dụng để chiết cho các hoạt động chất không bền với nhiệt.
Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn thời gian chiết làm tiết kiệm năng lượng đầu vào.
- Nhược điểm:
Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly.
Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một
lượng dịch chiết hoặc chiết chiết có thể bị nhiễm bẩn.
Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽảnh hưởng đến hiệu suất chiết.
b) Phương pháp ngâm
- Là phương pháp cho dược liệu đã chia nhỏ tới độ mịn thích hợp, tiếp xúc với dung môi trong thời gian nhất định, sau đó gạn, ép, lắng, lọc thu lấy dịch chiết. Tùy theo nhiệt độ chiết xuất, chia thành:
Ngâm lạnh: ngâm ở nhiệt độ phòng, có thể khuấy trộn, thường áp dụng với những dược liệu chứa hoạt chất dễ bị phân hủy bởi nhiệt.
Hãm: cho dung môi vào dược liệu đã chia nhỏ trong một thời gian xác định, có thể khuấy trộn, thường dung cho hợp chất dễ tan trong thời gian ngắn ở nhiệt độ cao.
Hầm: ngâm dược liệu đã chia nhỏ với dung môi trong một bình kín, giữ nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi nhưng cao hơn nhiệt độ phòng trong một thời gian nhất định, thỉnh thoảng có khuấy trộn, thường áp dụng với những chất ít tan ở nhiệt độ thường, dễ phân hủy ở nhiệt độ cao.
Sắc: đun sôi đều và nhẹ nhàng dược liệu với dung môi trong một thời gian nhất định
- Tùy theo số lần ngâm chia thành:
Ngâm một lần với toàn bộ dung môi
Ngâm nhiều lần với từng phân đoạn dung môi
- Ưu điểm:Đây là phương pháp đơn giản nhất, dễ thực hiện, thiết bị đơn giản, rẻ tiền.
- Nhược điểm:
Năng suất thấp, thao tác thủ công (giai đoạn tháo bã và nạp liệu).
Nếu chỉ chiết một lần thì không chiết kiệt được hoạt chất trong dược liệu.
Nếu chiết nhiều lần thì dịch chiết loãng, tốn dung môi, tốn thời gian chiết.
c) Phương pháp chiết soxhlet
- Tiến hành: dược liệu được cho vào một ống giấy lọc rồi đặt vào ngăn chiết. Dung môi mới được cho vào bình cầu và đun hồi lưu. Dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống ngăn chiết và khi tràn sẽ chảy qua ống xi phông bình cầu cầu bên dưới, mang theo các chất hòa tan từ dược liệu. Ở bình cất, chất tan được giữ lại, dung môi bốc hơi lên được ngưng tụ xuống bình chiết và đi qua lớp dược liệu để hòa tan các chất tan còn lại. Cứ như vậy cho đến khi dược liệu được chiết kiệt.
- Ưu điểm:
Quá trình chiết xuất liên tục
Tốn ít dung môi hơn các phương pháp trên
- Nhược điểm:
Dịch chiết luôn ở nhiệt độ sôi của dung môi nên các chất không bền với nhiệt dễ bị phá hủy.
Không thực hiện liên tục được sự khuấy trộn
Hình 1.13. Mô hình soxhlet
1.5.3. Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
- Phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn là phương pháp của Hadacek et al. (2000). Chủng vi khuẩn sau khi được hoạt hóa từống chủng gốc trên môi trường LB đặc, một khuẩn lạc được cấy chuyển sang 5 ml môi trường LB lỏng và lắc qua đêm ở nhiệt độ
37oC . Đĩa thử hoạt tính được chuẩn bị bằng cách cấy trải 200 μl dịch khuẩn, nồng độ
tương đương 4 – 5 × 108 CFU/ml lên bề mặt đĩa petri có chứa môi trường LB đặc, để khô và đục 5-6 giếng, đường kính khoảng 6 mm sao cho mỗi giếng cách nhau khoảng 2 – 3 cm. Chuẩn bị dịch chiết thử bằng cách hòa tan cặn chiết methanol của các mẫu thực vật trong DMSO thành các nồng độ theo yêu cầu. Bổ sung 50 μL dịch chiết thử
tiếng, tới khi dịch chiết từ các giếng khuếch tán ra môi trường nuôi cấy vi khuẩn; sau
đó, đặt các đĩa vào tủ ấm 37oC trong 24 giờ. Đối chứng dương là dung dịch kháng
sinh (Ampicilin 0,1 mg/ml với E. coli và P. mirabillis; Kanamycin 5 mg/ml với S.
aureus và P. vulgaris); đối chứng âm là DMSO.
- Hoạt tính ức chế khuẩn được đánh giá bằng cách đo bán kính (BK) vòng ức chế vi sinh vật bằng công thức:
BK = D – d
Trong đó: D = đường kính vòng vô khuẩn (mm) d = đường kính lỗ khoan thạch (mm) BK là vòng ức chế vi sinh vật (mm)
- Thí nghiệm được lặp lại ba lần và lấy giá trị bán kính trung bình.
1.5.4. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)
- Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độđặc hiệu cao được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp. Bản chất GC/MS là sự kết hợp của sắc ký khí và khối phổ.
- Nguyên tắc hoạt động:
Nhờ có khí man có trong bơm khí, mẫu từ buồng bơm hơi được dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký được diễn ra tại đây.
Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lượt đi vào
detector, tại đó chúng được chuyển thành tín hiệu điện.
Tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang bộ phận ghi. Các tín hiệu dược xử
lý ởđó rồi chuyển sang bộ phận in và lưu kết quả.
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1. Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Nguyên liệu sử dụng để chiết dịch chiết trong nghiên cứu này là: lá ổi non tại xã Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu.
Hình 2.1. Lá ổi non 2.1.2. Dụng cụ - thiết bị và hóa chất a) Dụng cụ - thiết bị Bảng 2.1. Bảng dụng cụ Dụng cụ Số lượng Dụng cụ Số lượng Bộ soxhlet 1 Nhiệt kế 1 Bình cầu 1, 2 cổ (500ml) 2 Cốc thủy tinh (500ml, 250ml,100ml) 8 Đĩa petri 18 Ống nghiệm ( 18) 10
Cốc sứ 2 Phễu chiết (250ml) 3
Que cấy đầu nhọn 3 Bóp cao su 1
Đèn cồn 1 Erlen (100ml, 250ml) 6
Bình tia 1 Đũa thủy tinh 1
Pipet (10ml, 5ml,
2ml, 1ml) 5 Ống đong (500ml,
250ml) 2
Giá đỡ ống nghiệm 1 Que cấy đầu tròn 1
Bảng 2.2. Bảng thiết bị
Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng
Máy đo UV – VIS 1 Bếp điện bình cầu 1
Máy cô quay chân không 1 Máy sắc khí phổ GC/MS 1
Cân phân tích (0.0001g) 1 Tủ sấy 1
Lò nung 1 Nồi hấp khử trùng 1
Máy xay 1 Máy đo pH 1
Máy ly tâm 1
b) Hóa chất
- Cồn 96o
- Dimethyl sulfoxit (DMSO)
- Dung dịch Folin - Ciocalteu - TSB - Ampicillin - BaCl2 - Na2CO3 10% - FeCl3 5% - Acid gallic - Agar - Tetracylin - MHA - MHB - MP - H2SO4 - Amonia 2.1.3. Vi khuẩn thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn dùng trong thí nghiệm có nguồn gốc tại trường Đại Học Công Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh. Chủng Staphylococcus aureus Chủng Escherichia coli Chủng Salmonella spp Chủng Bacilus cereus Chủng Pseudomonas aeruginosa
2.1.4. Các phương pháp nghiên cứu [3]
- Nghiên cứu lý thuyết: nghiên cứu các hợp chất tự nhiên, tổng quan các tài liệu vềđặc
điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, ứng dụng của lá ổi non. - Các phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
Nghiên cứu chiết tách dịch chiếtbằng phương pháp soxhlet với các điều kiện khảo sát là tỉ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết.
Nghiên cứu phương pháp trọng lượng: xác định độ ẩm, hàm lượng tro của lá ổi
Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong cao chiếtlá ổi non bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS.
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế vi khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch.
2.2. Xử lý nguyên liệu
Cây ổi lấy toàn bộ lá vừa và non. Chọn những lá tươi, không bị sâu bệnh, nấm mốc.
Đem đi rửa sạch phần bị bẩn, sấy ở nhiệt độ 60oC tới cho đến khi mẫu khô giòn, có khối lượng không đổi.
Hình 2.2. Lá ổi sấy khô và sau khi được xay nhỏ 0.5 – 1cm 2.3. Đề xuất quy trình chiết cao từ lá ổi non
Sơ đồ 2.1. Quy trình đề xuất chiết cao từ lá ổi non 2.3.2. Thuyết minh quy trình
- Bước 1: Lá ổi (vừa và non) sau khi được thu hái loại bỏ những lá sâu, đem đi rửa sạch loại bỏ bẩn, rồi sấy ở nhiệt độ 60oC tới nhiệt độkhông đổi. Xay nhỏ 0.5 – 1 cm rồi cân chính xác 10 g (± 0,1 g). Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).
- Bước 2: Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm). Đong