Xử lý nguyên liệu

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

2.2. Xử lý nguyên liệu

Cây ổi lấy toàn bộ lá vừa và non. Chọn những lá tươi, không bị sâu bệnh, nấm mốc.

Đem đi rửa sạch phần bị bẩn, sấy ở nhiệt độ 60oC tới cho đến khi mẫu khô giòn, có khối lượng không đổi.

Hình 2.2. Lá ổi sấy khô và sau khi được xay nhỏ 0.5 – 1cm 2.3. Đề xuất quy trình chiết cao từ lá ổi non 2.3. Đề xuất quy trình chiết cao từ lá ổi non

Sơ đồ 2.1. Quy trình đề xuất chiết cao từ lá ổi non 2.3.2. Thuyết minh quy trình 2.3.2. Thuyết minh quy trình

- Bước 1: Lá ổi (vừa và non) sau khi được thu hái loại bỏ những lá sâu, đem đi rửa sạch loại bỏ bẩn, rồi sấy ở nhiệt độ 60oC tới nhiệt độkhông đổi. Xay nhỏ 0.5 – 1 cm rồi cân chính xác 10 g (± 0,1 g). Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm).

- Bước 2: Chuyển toàn bộ nguyên liệu đã được xử lý cho vào túi lọc (10 x 5 cm). Đong

250 ml cồn 96 cho vào bình cầu 2 cổ và lắp hệ thống chiết soxhlet. Đun nguyên liệu trong 120 phút , ở nhiệt độ 78oC.

- Bước 3: Dịch trích sau đó được lọc, cô quay đuổi dung môi hoàn toàn, thu được cao. Cao lá ổi non được bảo quản trong lọ thủy tinh đậy kín ở 4oC, tránh ánh sáng.

- Bước 4: Đem cao chiết đi phân tích GC/MS để xác định thành phần hóa học và thử

hoạt tính sinh học trên khuẩn E.Coli, Bacilus cereus, Staphylococcus aureus, Salmonella spp và Pseudomonas aeruginosa.

Chiết bằng phương pháp

soxhlet

Cao chiết thô

Khảo sát tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tối ưu:

1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 và 1:50 g/ml Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm, hàm lượng tro Khảo sát yếu tốảnh hưởng đến quá trình chiết: nhiệt độ Xác định thành phần hóa học bằng phương pháp GC/MS Nguyên liệu Thử hoạt tính kháng khuẩn Cô quay Dịch chiết Xử lý Sấy khô, xay nhỏ

Khảo sát thời gian chiết tối ưu: 60 phút, 90

phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút

2.4. Đề xuất mô hình chưng cất thực nghiệm tại phòng thí nghiệm

Hình 2.3. Mô hình chiết cao lá ổi non tại phòng thí nghiệm 2.5. Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý [1] 2.5. Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý [1]

2.5.1. Xác định độ ẩm

- Chuẩn bị 3 chén sứ đã đánh số, rửa sạch, tráng lại bằng nước cất, sấy khô đến khối lượng không đổi. Sau đó, cân lấy trọng lượng m1 (g).

- Cân khoảng 3g lá ổi non (đã được xử lý) cho vào chén sứ đã chuẩn bị sẵn ta có m2 (g).

- Đem sấy ở nhiệt độ 100oC, cứ sau 2h lấy ra để trong bình hút ẩm cho nguội rồi cân, làm như vậy cho đến khi khối lượng mẫu và chén sứ xem như không đổi  kết quả m3 (g).

- Công thức tính độ ẩm:

 Độẩm của mỗi mẫu:

(%) = (𝑚1+ 𝑚2)− 𝑚3

 Độẩm trung bình:

TB(%) = ∑𝑛1(%) 𝑛

Trong đó: m1: trọnglượng chén sứ (g)

m2: trọnglượng lá ổi non (g)

m3: trọng lượng cốc sứ và mẫu sau khi sấy (g) n: số lần xác định (%).

2.5.2.Xác định hàm lượng trobằng phương pháp tro hóa mẫu

- Các mẫu lá ổi non (m3) đã xác định độ ẩm ở trên tiếp tục được sử dụng để hóa tro. Các mẫu được cho vào lò nung và tiến hành tro hóa mẫu ở nhiệt độ 600oC trong thời gian từ 6h, cho đến khi thu được tro màu xám trắng. Lấy mẫu ra làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút ẩm, cân lại mẫu đến khối lượng không đổi, có khối lượng

m4.

- Công thức tính hàm lượng tro:

 Hàm lượng tro của mỗi mẫu:

% tro = 𝑚4− 𝑚1

𝑚2 x 100%

 Hàm lượng tro trung bình:

% tro trung bình = ∑ 𝑡𝑟𝑜𝑛1 𝑛

Trong đó: m1: khối lượng chén sứ (g)

m2: khối lượng lá ổi non ban đầu (g)

m3: khối lượng cốc sứ và mẫu sau khi tro hóa (g)

n: số lần xác định % tro

2.6. Khảo sát điều kiện chiết

- Khi nghiên cứu về chiết tách dịch chiết từ lá ổi non bằng phương pháp chiết soxhlet, các yếu tố đầu tiên cần phải nghiên cứu là tỷ lệ nguyên liệu/dung môi và thời gian chiết. Đó là các yếu tốảnh hưởng trực tiếp đến lượng dịch chiết thu được.

Bảng 2.3. Bảng khảo sát điều kiện chiết STT Tên thông số Giá trị thông số STT Tên thông số Giá trị thông số

1 Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40, 1:45 và 1:50 g/ml 2 Thời gian chiết 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút

- Khối lượng lá ổi non khô cho mỗi lần thí nghiệm là 10 g. Các thông số khảo sát sơ

bộ là tiền đề quan trọng để tìm các thông số thích hợp. Kết quả nghiên cứu được trình

bày như sau:

2.6.1.Khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi a) Mục đích a) Mục đích

- Tỷ lệ dung môi là tỷ lệ (khối lượng nguyên liệu khô/thể tích dung môi) cần thiết và hợp lý đủđể dung môi thẩm thấu vào nguyên liệu. Nghiên cứu tỷ lệdung môi để xem xét ở tỷ lệ dung môi nào thì dịch chiết khuếch tán tốt nhất và đạt tỷ lệ cao nhất. - Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi ảnh hưởng mạnh đến hiệu suất thu dịch chiết. Lượng

dung môi quá nhiều thì dịch chiết thu được sẽ bị pha loãng, lẫn nhiều tạp chất. Thể

tích dung môi quá ít thì không chiết kiệt được hoạt chất có trong nguyên liệu.

b) Cách tiến hành

- Chuẩn bị 7 mẫu, mỗi mẫu cân khoảng 10 g lá ổi non (đã được xử lý), cho vào túi lọc, tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 78oC trong 4 giờ với các thể tích cồn tuyệt đối khác nhau 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml và 500 ml.

- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao. Rồi đem đi cân lấy khối lượng  Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu.

2.6.2. Khảo sát thời gian chiếta) Mục đích a) Mục đích

- Thời gian chiết càng lâu lượng dịch thu được càng nhiều. Tuy nhiên, đến một thời

điểm nào đó thì lượng dịch thu được không tăng mặc dù thời gian ta kéo dài thêm. - Mặt khác, kéo dài thời gian chưng cất còn ảnh hưởng đến chất lượng dịch chiết do

nguyên liệu bị cháy khét làm mất mùi thơm tự nhiên của cao sau khi cô quay, đồng thời năng lượng tiêu tốn nhiều dẫn đến chi phí sản xuất tăng, không có hiệu quả về

kinh tế.

b) Cách tiến hành

- Chuẩn bị 5 mẫu, mỗi mẫu khoảng 10g lá ổi non (đã được xử lý) với khoảng 250ml cồn tuyệt đối rồi tiến hành chiết soxhlet ở nhiệt độ 78oC với các thời gian khác nhau 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút.

- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao. Rồi đem đi cân lấy khối lượng  Thời gian chiết tối ưu.

2.7. Khảo sát yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng đến dịch chiết lá ổi [2]

- Lấy các mẫu dịch chiết bằng dung môi cồn tuyệt đối bảo quản trong các điều kiện khác nhau là vừa mới chiết, để ở nhiệt độ phòng, để trong tủ lạnh.

- Sau 5 ngày lấy ra quan sát.

2.8. Tính hiệu suất chiết xuất cao thô

Cao lá ổi non sau khi cô quay được tính hiệu suất theo công thức sau: %H = mcao

mnguyên liệu x 100

Trong đó: %H là hiệu suất cao thô (%)

mcao là khối lượng cao thu được (g)

mnguyên liệu là khối lượng lá ổi non được dùng để chiết (g)

2.9. Định tính Flavonoid [3], [5]

- Trong thành phần hóa học của lá ổi thì Flavonoid là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, đang được quan tâm. Vì vậy có các phản ứng đặc trưng: tạo dụng dịch màu xanh lục đen khi tác dụng với FeCl3 5 %, vết Flavonoid có màu vàng khi tiếp xúc với hơi

amoniac.

 Dung dịch FeCl3 5 %: lấy khoảng 10 ml dịch chiết cho vào 2 ống nghiệm.

 Ống 1: để đối chứng.

 Ống 2: thêm vài giọt FeCl3 5 %

Để yên, quan sát và nhận xét.

 Hơi amoniac: lấy khoảng 10 ml amoniac cho vào ống nghiệm, tẩm vài giọt dung dịch chiết lá ổi non lên tờ giấy lọc, hơ giấy lọc trên miệng ống nghiệm. Quan sát và nhận xét.

2.10. Xác định thành phần hóa học trong caolá ổi non bằng phương pháp GC/MS

Dịch chiết lá ổi non được tiến hành thu hồi dung môi cho tới khi được chất rắn dạng cao. Gửi mẫu cao đến Chi cục Kiểm Định Hải Quan 4 tại số 10, đường Ngô Quyền, phường Thọ Quang, quận Sơn Trà, thành phố Đà Nẵng.

2.11. Thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [9] khuẩn [9]

2.11.1.Chuẩn độ đục

Sử dụng thang độ đục chuẩn MacFarland 0,5 được chế bằng cách sau: lấy 0,5 ml BaCl2 0,48 M trộn đều với 99,5 ml H2SO4 0,35 M đồng thời khuấy liên tục để tạo

huyền dịch. Chia thành các ống có cùng cỡ với ống dùng để chuẩn độ vi sinh vật, mỗi

ống 4 – 6 ml huyền dịch, đậy nút. Đểở chỗ tối trong tủ lạnh và có thể sử dụng được

trong vòng 6 tháng. Độđục này tương ứng với 108 CFU/ml.

2.11.2.Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm

Giống trước khi sử dụng được tăng sinhtrên môi trường TSB trong 12 giờở 37oC, ly

tâm tốc độ quay 4000 vòng trong 5 phút. Huyền phù vi khuẩn sau đó được ly tâm

tách sinh khối và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độđục tương đương 0,5 MC Farland.

2.11.3.Chuẩn bị nồng độ chất thử

- Cân 1.6 g cao cho vào 1 ml DMSO 5% được dung dịch gốc. Dung môi DMSO được

tiệt trùng, khi sử dụng pha loãng thành dung môi thử nghiệm thành các nồng độ trong

môi trường thử nghiệm như sau: 1600 mg/ml, 800 mg/ml, 400 mg/ml và 200 mg/ml. - Kháng sinh đối chứng dương gồm ampicillin và tetracylin. Mẫu đối chứng âm là dung

dịch DMSO 5%.

2.11.4.Tiến hành thí nghiệm

Cho vào mỗi đĩa petri 25 ml môi trường MHA vô trùng (khoảng 50 – 60oC) để yên cho môi trường đông đặc, thêm 100 µl dịch vi khuẩn mật độ 1,5 x 108 CFU/ml. Mỗi

đĩa petri được đặt 1 đĩa kháng sinh chứng dương và 6 đĩa giấy trắng đường kính 6mm

vô trùng. Cho vào 5 đĩa trắng lần lượt 1 l dịch chiết đã phavà 1 đĩa còn lại 1 l dung dịch DMSO 5 % làm chứng âm. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Các đĩa ở 32oC trong 16 – 20 giờ. Đường kính vòng ức chếđược đo bằng thước đo đơn vị mm.

2.11.5.Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn

Đường kính vòng vô khuẩn (D –d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừđi đường kính đĩa giấy.

CHƯƠNG 3: KẾT QỦA VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả xác dịnh một số chỉ tiêu hóa lý của lá ổi non 3.1.1. Độẩm [17] 3.1.1. Độẩm [17]

- Lá ổi non (đã được xử lý) được tiến hành xác định độẩm. Sốlượng mẫu được lấy để xác định độẩm là 3 mẫu. Độẩm chung là độẩm trung bình của 3 mẫu.

- Kết quảxác định độẩm trung bình của mẫu được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát độẩm STT m1 (g) m2 (g) m3 (g) (%) STT m1 (g) m2 (g) m3 (g) (%) 1 30.05 3.001 32.713 11.263 2 28.733 3.003 31.395 11.355 3 28.014 3.001 30.673 11.396 Độẩm trung bình 11.388

Hình 3.1. Mẫu sau khi được xác định độẩm

 Độẩm trung bình của dược liệu lá ổi non là 11.388 %. Độẩm này nằm trong giới hạn cho phép vềđộẩm an toàn áp dụng đối với đa sốdược liệu. Tất cảcác dược liệu,

trong điều kiện bảo quản bình thường, đều có chứa một lượng nước nhất định. Tỉ lệ

phần trăm của lượng nước này trong dược liệu được gọi là độẩm (hay thủy phần) của

dược liệu. Muốn bảo quản dược liệu, tránh hiện tượng lên meo mốc, hoạt chất trong

dược liệu không bị biến đổi thì dược liệu phải có độ ẩm 10 – 12 % đó là độ ẩm an toàn với đa sốdược liệu.

3.1.2. Hàm lượng tro

- Lấy 3 mẫu lá ổi non đã được xác định độẩm ở trên, nung trong lò nung ở nhiệt độ

600oC để xác định hàm lượng tro.

- Kết quảxác định hàm lượng tro trung bình được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.2.

2 3

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát độẩm

STT m1 (g) m2 (g) m4 (g) % tro

1 30.05 3.001 30.307 8,564

2 28.733 3.003 28,956 7,431

3 28.014 3.001 28,262 8,264

Hàm lượng tro trung bình 8,086

Hình 3.2. Mẫu sau khi được hóa tro

 Từ bảng 3.2 cho thấy hàm lượng tro trung bình là 8,086 %. Trong thành phần của

tro vô cơ có thể có các muối của một số kim loại nặng như Fe, Cu, Pb, Hg, Zn,… Các kim loại này có thểảnh hưởng đến tính chất của dịch chiết từ lá ổi non.

3.2. Kết quả khảo sát điều kiện chiết lá ổi non 3.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi 3.2.1. Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi

- Cân khoảng 10 g lá ổi non (đã được xử lý) cho vào túi lọc. Tiến hành chiết soxhlet trong 4h với các thể tích cồn 96o khác nhau: 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml và 500 ml. Hình 3. 3. Dịch chiết ở các nồng độ khác nhau 1 2 1 3

- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao. Rồi đem đi cân lấy khối lượng  Tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu.

- Kết quả mật độ quang của các mẫu được trình bày ở bảng 3.3 và biểu đồ 3.1.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi STT Khối lượng lá ổi STT Khối lượng lá ổi

(g)

Thể tích dung môi (ml)

Khối lượng cao thu được (g) 1 10,00l 200 1.112 2 10,001 250 1.2 3 10,02 300 0.908 4 10,005 350 0.886 5 10.00 400 0.745 6 10,003 450 0.7 7 10,004 500 0.678

Biểu đồ 3.1. Biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu

 Từ bảng 3.3 và biểu đồ 3.1 ta thấy khi tăng thể tích dung môi đến 250 ml thì khối

lượng cao thu được là cao nhất, nhưng khi tiếp tục tăng thể tích dung môi thì khối

lượng cao giảm do chất đã được chiết ra gần như hoàn toàn. Vì vậy tỉ lệ nguyên liệu/dung môi tối ưu tỷ lệ 1:25 g/ml.

3.2.2. Khảo sát thời gian chiết

- Cân khoảng 10 g lá ổi non (đã được xử lý) cho vào túi lọc. Tiến hành chiết soxhlet với 250 ml dung môi cồn 96o trong các thời gian khác nhau: 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút, 180 phút và 210 phút. 1.112 1.2 0.908 0.886 0.745 0.7 0.678 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 200 250 300 350 400 450 500 Khối lư ợng cao thu đư ợc (g) Thể tích dung môi (ml)

- Dịch chiết thu được đem đi cô quay, được sản phẩm là cao. Rồi đem đi cân lấy khối lượng  Thời gian tối ưu.

Hình 3.4. Dịch chiết được chiết ở thời gian khác nhau

- Kết quả mật độ quang của mẫu được trình bày ở bảng 3.4 và biểu đồ 3.2.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát thời gian chiết STT Khối lượng lá ổi STT Khối lượng lá ổi (g) Thời gian chiết (phút) Khối lượng cao thu được (g) 1 10.002 60 0.543 2 10.004 90 0.575 3 10.001 120 1.128 4 10.000 150 0.767 5 10.001 180 0.745 6 10.000 210 0.735

Biểu đồ 3.2. Biểu diễn kết quả khảo sát tỷ lệ thời gian tối ưu

0.543 0.575 1.128 0.767 0.745 0.735 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 60 90 120 150 180 210 Khối lư ợng cao thu đư ợc (g)

 Từ bảng 3.4 và hình 3.8 ta thấy, khi tăng thời gian chiết thì khối lượng cao tăng và

đến t = 120 phút thì khối lượng cao là lớn nhất, tiếp tục tăng thể tích dung môi thì khối lượng cao giảm không đáng kể. Vì vậy thời gian chiết tối ưu là 120 phút.