Phần 3 Nội dun g nguyên liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.7. Phương pháp HA, HI giám định virus
3.5.7.1. Phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA)
Phương pháp HA được tiến hành phản ứng trên đĩa microtier 96 giếng đáy chữ v (tổng lượng hỗn dịch là 75µl/ giếng), các bước tiến hành như sau:
- Cho 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 vào các giếng của đĩa phản ứng. - Cho 25 µl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt đầu pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2 từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11. - Nhỏ 25 µl dung dịch PBS vào các giếng từ 1 đến giếng 12.
- Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà tống khỏe mạnh) vào các giếng từ 1 đến giếng 12. Để 15- 30 phút ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả ngưng kết.
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết toàn phần.
3.5.7.2. Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phương pháp HI cũng được tiến hành trên đĩa microtiter 96 giếng đáy chữ V. Sau khi đã biết hiệu giá HA của virus, virus được pha thành dung dịch kháng nguyên có chứa 4 đơn vị HA, các bước tiến hành phản ứng như sau: - Cho 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 vào các giếng của đĩa phản ứng.
- Cho 25 µl kháng huyết thanh chuẩn A/H5N1, A/H5N6 đã biết được pha loãng với PBS theo cơ số 2.
- Sau đó nhỏ vào mỗi giếng 25 µl dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị HA, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Tiếp tục nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% vào các giếng, để 15-30 phút và đọc kết quả.
Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh còn có hiện tượng ức chế hoàn toàn ngưng kết hồng cầu.
Khi tiến hành phản ứng HI với kháng huyết thanh chế từ chồn (ferret), huyết thanh được pha loãng trước ở 1/10, rồi tiếp tục pha theo cơ số 2.