Phần 3 Nội dun g nguyên liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp giải trình tự gen
3.5.2.1. Phương pháp nhân gen HA
- Chiết tách ARN (xem 2.4.1.1)
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Trình tự primer để nhân gen HA
Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
Cặp 1
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG GGT YTA AT
S18_H5- 1111R
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C
Cặp 2
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA TTG TCA AG
S20_H5- R1773
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat. No. 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4).
- Chu trình nhiệt:
+ 1 vòng ở 50 °C trong 20 phút + 1 vòng ở 95 °C trong 2 phút
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 61 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 59 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 57 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
+ Chu trình 35 vòng: 95 °C trong 10 giây + 55 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng ở 25 °C trong 1 phút. Bảng 3.4. Thành phần của phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) PCR superMix 12,5 Mồi xuôi (20 μM) 0,5 Mồi ngược (20 μM) 0,5 MgSO4 50 (μM) 0,5 Enzym 1,0 Nước cất sạch nuclease 8,5 Mẫu ARN 2,0
3.5.2.2. Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment).
- Lập cây phả hệ cho virus cúm (chuỗi gen HA) bằng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) sử dụng phương pháp Neighbor-joining (NJ). Lập cây phả hệ so sánh với các virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 2.3.2.1c A/Hong_Kong/6841/2010(H5N1) và A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014 (H5N6).