Việt Nam
Một số công trình nghiên cứu về nguồn gốc của virus cúm A/H5N1 cho thấy liên tục có sự xuất hiện các biến chủng (clade) mới của virus CGC tại Việt Nam (bảng 2.1,hình 2.3). Các nghiên cứu cho thấy, tại Việt Nam có nhiều chủng virus cúm đã lưu hành. Các nhánh 0, 1, 2.3.2, 2.3.4, 3, 5, 8 đã được phân lập ở Việt Nam. Một số nhánh chỉ tồn tại trong thời gian ngắn: nhánh 3 (2001), nhánh 5 (2002-2003), nhánh 8 (2005), nhánh 0 (2005) (Pfeiffer et al., 2011). Sự xuất hiện các biến chủng mới theo thời gian làm cho tình hình dịch bệnh trở nên phức tạp, làm giảm, thậm chí vô hiệu hóa hiệu quả của các chiến dịch tiêm phòng.
Virus cúm A/H5N1 có đặc tính là biến chủng rất nhanh và đến nay đã có nhiều biến chủng A/H5N1 đã được phát hiện và phân lập ở nhiều nước khác nhau từ châu Á sang châu Âu. Đặc biệt, Việt Nam chúng ta đã cũng đã phát hiện được nhiều chủng virus A/H5N1 khác nhau được phân loại vào các nhánh khác nhau như: 1, 3, 2.3.4, 2.3.2.1…(Cục Thú y, 2012). Bên cạnh đó,
cũng từ năm 2014 đến nay, Việt Nam xuất hiện subtype A/H5N6 của virus cúm type A, gây nên các ổ dịch ở các tỉnh miền Bắc và miền Trung. Virus có nguồn gốc gien HA thuộc về nhánh 2.3.4.4 là phân nhánh của nhánh 2.3.4 đã từng lưu hành trong các năm 2008 – 2012 và gây ra những thiệt hại lơn cho ngành chăn nuôi gia cẩm ở nước ta.
Tất cả các virus cúm subtype A/H5N1 đều thuộc nhánh 2.3.2.1c và chủ yếu lưu hành ở các tỉnh phía nam. Tuy nhiên chúng vẫn xuất hiện rải rác ở các tỉnh phía Bắc và Miền Trung. Các virus A/H5N6 thuộc về 2 nhánh là 2.3.4.4a (dòng Trung Quốc) và 2.3.4.4b (dòng Lào) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh Phía Bắc và Miền Trung. Đặc biệt, nhánh 2.3.4.4b xuất hiện nhiều hơn trong năm 2015 và đầu năm 2016. Các tỉnh phía Nam chưa phát hiện được virus A/H5N6 từ mẫu ổ dịch. Và đặc biệt các chủng virus cúm A/H5 được phân lập trong nghiên cứu này cũng thuộc 2 phân nhánh là 2.3.4.4b và 2.3.2.1c.
Kể từ năm 2008, nhiều chủng virus cúm HPAI/H5 với subtype NA không phải N1 như A/H5N2, A/H5N5, A/H5N6, A/H5N8 đã xuất hiện ở Trung Quốc ( Liu, Liu và cs. 2013). Trong hai năm 2013-2014, các chủng virus HPAI H5Nx cũng đã được phát hiện ở nhiều vùng lãnh thổ khác ngoài Trung Quốc như Lào, Nhật Bản, Hàn Quốc, Châu âu, Mỹ, Canada (Lee Kang et al., 2014). Các báo cáo phân tích gia hệ gen HA của những virus HPAI A/H5Nx cũng cho thấy chúng thuộc về nhánh 2.3.4 nhưng không nằm trong các phân nhánh 2.3.4.1, 2.3.4.2 và 2.3.4.3 mà tạo thành những nhánh virus mới trong nhánh 2.3.4. Theo tiêu chí định nghĩa clade của Nhóm Nghiên cứu Tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO (Group 2008), phần lớn những virus cúm HPAI H5Nx phát hiện trong năm 2013-2014 đều được các tác giả nghiên cứu phân loại vào phân nhánh 2.3.4.6. Ngày 12/01/2015, Tổ chức y tế thế giới đã khuyến cáo sử dụng phân nhánh 2.3.4.4 gọi thay cho phân nhánh 2.3.4.6 sau khi nhóm nghiên cứu tiến hóa virus cúm H5N1 WHO/OIE/FAO tiến hành phân tích tất cả những trình tự gen H5 gần đây (WHO 2015).
Virus cúm A/H5N1 xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2001 tại các chợ buôn bán gia cầm sống tại Hà Nội (nhánh 0) nhưng chỉ thực sự gây ra dịch bệnh vào cuối năm 2003 (Nguyễn Tiến Dũng và cs., 2004; Trương Văn Dung và cs., 2004). Một số công trình nghiên cứu về nguồn gốc của virus cúm A/H5N1 trong thời gian qua cho thấy liên tục có sự xuất hiện các biến chủng (clade) mới của virus cúm gia cầm tại Việt Nam. Từ khi xuất hiện lần đầu
tiên tại Việt Nam năm 2003 cho đến năm 2005, bệnh CGC ở tất cả các tỉnh thành trên cả nước được gây ra chủ yếu do biến chủng virus nhánh 1 (Wan Nguyen và cs., 2008), bên cạnh đó nhánh 2.3.2 cũng được phát hiện năm 2005. Năm 2006, tình hình dịch CGC tạm lắng do các biện pháp làm giảm nguồn bệnh được áp dụng như cấm ấp nở thủy cầm (loài mang trùng virus CGC) và tiêm phòng vắc xin trên phạm vi cả nước cho gia cầm bằng vắc xin Re-1 (nhánh 0). Từ năm 2007 đến giữa năm 2010, có sự khác biệt địa lý về lưu hành của các biến chủng virus CGC, các nhánh 2.3.4 dòng Phúc Kiến (sau đó phân chia thành các phân nhánh 2.3.4.1, 2.3.4.2, 2.3.4.3) đã chiếm ưu thế ở các tỉnh phía Bắc, trong khi đó, các nhánh 1 và phân nhánh 1.1 (tiến hóa từ nhánh 1) lưu hành chủ yếu ở các tỉnh phía Nam và sau đó tiếp tục tiến hóa thành các nhánh 1.1.1 và 1.1.2 (Nguyen và cs., 2008). Trong thời gian này, vắc xin Re-1 và Re-5 (nhánh 2.3.4) nhập khẩu từ Trung Quốc đã được sử dụng, đồng thời một vắc xin trong nước dùng chủng NIBRG-14 (nhánh 1) được thử nghiệm. Năm 2008, nhánh 7 được phát hiện trên gia cầm nhập lậu ở Lạng Sơn và một số chợ ở Hà Nội. Năm 2010-2011, nhiều biến chủng nhánh mới đã nổi lên, nhánh 2.3.2.1 (Xuất hiện cuối 2009) trở nên thịnh hành vào cuối năm 2010 và tiến hóa thành các nhánh 2.3.2.1a,b (Nguyen và cs., 2012) lưu hành ở các tỉnh phía Bắc, các nhánh 1.1.1 và 1.1.2 tiếp tục lưu hành ở các tỉnh phía Nam. Giữa năm 2012 nhánh 2.3.2.1c xuất hiện ở miền Bắc, sau đó nhanh chóng lây lan vào miền Trung và miền Nam Việt Nam, các nhánh 2.3.2.1a và b dần biến mất. Năm 2013, chỉ còn nhánh 2.3.2.1c lưu hành trên cả nước và nhánh 1.1.2 vẫn khu trú ở các tỉnh phía Nam. Đầu năm 2014, các nhánh 2.3.2.1c và 1.1.2 vẫn là những nhánh chính gây bệnh CGC ở Việt Nam, tuy nhiên sau tháng 2 năm 2014, nhánh 1.1.2 không còn được phát hiện. Từ tháng 4 năm 2014, các dịch cúm thuộc nhánh 2.3.4.4 bắt đầu xuất hiện ở miền Bắc (Lạng Sơn) vào tháng 4 năm 2014, sau đó xuất hiện ở một số tỉnh miền Bắc như Lào Cai (tháng 8/2014), Phú Thọ (9/2014), Lạng Sơn (11/2014). Virus đã nhanh chóng phát hiện ở một số tỉnh miền Trung như Hà Tĩnh (6/2014), Quảng Ngãi (8/2014), Quảng Trị (8/2014) (Thọ và cs., 2016). Và năm 2015-2016, virus cúm A/H5N6 thuộc phân nhánh 2.3.4.4a và 2.3.4.4b vẫn tiếp tục được phát hiện ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung, virus thuộc nhánh 2.3.2.1c vẫn được phân lập và phát hiện ở các tỉnh phía Nam (Cục Thú y, 2016). Bảng 2.1.
Hình 2.3. Sự phân bố không gian của các nhánh virus cúm gia cầm từ tháng 7/2016 tới tháng 6/2017
Bảng 2.1. Sự phân bố theo thời gian của virus cúm gia cầm ở Việt Nam
Năm Miền Bắc Miền Trung Miền Nam
2003
Nhánh 1, 5 (Wan XF et
al. 2008)
2004 Nhánh 1, 2.3.2 (Wan XF et al. 2008) Nhánh 1 (Wan XF et al. 2008) Nhánh 1 (Wan XF et al. 2008) 2005 Nhánh 1, 2.3.2 (Wan XF et al. 2008) Nhánh 1, 2.3.2 (Wan XF et al. 2008) Nhánh 1, 2.3.2 (Wan XF et al. 2008) 2006 2007 Nhánh 2.3.4.2, 2.3.4.3, 2.3.4 (Nguyen T et al.
2012) Nhánh 2.3.4.3 (Wan XF et al. 2008) Nhánh 1, 2.3.4 (Wan XF et al. 2008)
2008 Nhánh 2.3.4.2, 2.3.4.3 (Nguyen T et al. 2012) Nhánh 2.3.4.3 (Nguyen T et al. 2012) Nhánh 1.1b, 2.3.4.2 (Nguyen T et al. 2012) 2009 Nhánh 1.1B, 2.3.4.1, 2.3.4.2 (Nguyen T et al. 2012) Nhánh 1.1B (Nguyen T et al. 2012) Nhánh 2.3.4.1, 1.1A (Nguyen T et al. 2012) 2010 Nhánh 2.3.2.1a, 2.3.4.1, 1.1 (Creanga A et al. 2013) Nhánh 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.4.1, 1.1.1 (Nguyen T et al. 2012) Nhánh 1.1.1 (Creanga A et al. 2013) Nhánh 1.1.2 (Nguyen TD et al. 2014) 2011 Nhánh 2.3.2.1a (Creanga A et al. 2013), 2.3.2.1b, 1.1.2 (Nguyen TD et al. 2014) Nhánh 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.4.1, 1.1.1 (Nguyen T et al. 2012) Nhánh 1.1.1 (Creanga A et al. 2013) Nhánh 1.1.2 (Nguyen TD et al. 2014) 2012 Nhánh 2.3.2.1a (Creanga A et al. 2013), 2.3.2.1b, 2.3.2.1c (Nguyen TD et al. 2014) Nhánh 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.4.1, 1.1.2 (Creanga A et al. 2013) Nhánh 1.1.1, 1.1.2, 2.3.2.1c (Nguyen TD et al. 2014) 2013 Nhánh 7.2, 2.3.2.1a, 2.3.2.1b, 2.3.2.1c (Nguyen TD et al. 2014) Nhánh 2.3.2.1a, 2.3.2.1c, 1.1.2 (Nguyen TD et al. 2014) 2014 Nhánh 2.3.4.4 Nhánh 2.3.2.1c (Nguyen TH et al. 2016 2015- 2016 Nhánh 2.3.4.4 Nhánh 2.3.4.4 Nhánh 2.3.2.1c 2017 Nhánh 2.3.4.4, Nhánh 2.3.2.1c Nhánh 2.3.4.4, Nhánh 2.3.2.1c Nhánh 2.3.2.1c
PHẦN 3. NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ÐỊA ÐIỂM NGHIÊN CỨU
Địa điểm lấy mẫu: Các chợ buôn bán gia cầm sống tại tỉnh Quảng Nam. Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương.
3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Từ 6 tháng cuối năm 2016 đến 6 tháng đầu năm 2017 (12 tháng).
3.3. ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Mẫu dịch ngoáy hầu họng (swab) của gà và vịt lấy tại các chợ buôn bán gia cầm ở tỉnh Quảng Nam: Mẫu được lấy trong 6 tháng của năm 2016 và 6 tháng của đầu năm 2017. Mỗi tháng lấy 90 mẫu swab hầu họng (30 gà, 60 vịt) tại 3 chợ (thuộc 3 huyện).
Phôi trứng gà 8-10 ngày tuổi (lấy từ gà khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm).
Tế bào xơ phôi gà (tế bào xơ phôi được làm từ trứng gà có phôi 8-10 ngày tuổi).
Kít tách chiết ARN: bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep.
Mastermix: Sử dụng kít rRT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR. PCR superMix (Cat. No. 11306-016, Invitrogen)
Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, H5N6 Primer và kít để giải trình tự gen .
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Xác định được tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A trên gà, vịt. Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5 trên gà, vịt.
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gà, vịt. Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo tháng.
thông qua giải trình tự gen HA.
3.4.2. Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1, A/H5N6 A/H5N6
Tính thích ứng trên phôi gà.
Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, A/H5N6
3.5.1.1. Phương pháp tách chiết ARN
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARN bằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200 l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 l Qiagen buffer RLT có 1 % -ME, lắc đều trên máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Thêm 500 l etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.
- Nhỏ 500 l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu.
- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 l nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR. Nếu để sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm 20oC hoặc nhiệt độ thấp hơn.
3.5.1.2. Phương pháp Real time RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Thực hiện phản ứng Real time RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và probe (Bảng 3.1) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, A/H5N6 (theo quy trình chẩn đoán – TCVN 8400-26:2014).
Bảng 3. 1. Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6
Mồi/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu 5’ 3’
M
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA H5
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC N1
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1
Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C N6
Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGC CCA GAC CC FAM BHQ1 Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG
Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC
Trong đó
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng Real time RT-PCR
Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) 2x Reaction buffer 12,5 Mồi xuôi 20 μM 0,5 Mồi ngược 20 μM 0,5 Taqman probe 6 μM 0,5 Enzyme mix 0,5 Nước cất sạch nuclease 5,5 Mẫu ARN 5,0
- Chu trình nhiệt của phản ứng: + 1 vòng ở 50 oC trong 15 phút + 1 vòng ở 95 oC trong 2 phút
+ Chu trình 40 vòng: 95 oC trong 10 giây + 58 oC trong 50 giây.
3.5.2. Phương pháp giải trình tự gen
3.5.2.1. Phương pháp nhân gen HA
- Chiết tách ARN (xem 2.4.1.1)
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3).
Bảng 3.3. Trình tự primer để nhân gen HA
Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
Cặp 1
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG GGT YTA AT
S18_H5- 1111R
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C
Cặp 2
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA TTG TCA AG
S20_H5- R1773
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat. No. 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4).
- Chu trình nhiệt:
+ 1 vòng ở 50 °C trong 20 phút + 1 vòng ở 95 °C trong 2 phút
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 61 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 59 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 57 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
+ Chu trình 35 vòng: 95 °C trong 10 giây + 55 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút. + 1 vòng ở 25 °C trong 1 phút. Bảng 3.4. Thành phần của phản ứng RT-PCR Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) PCR superMix 12,5 Mồi xuôi (20 μM) 0,5 Mồi ngược (20 μM) 0,5 MgSO4 50 (μM) 0,5 Enzym 1,0 Nước cất sạch nuclease 8,5 Mẫu ARN 2,0
3.5.2.2. Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment).
- Lập cây phả hệ cho virus cúm (chuỗi gen HA) bằng phần mềm MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) sử dụng phương pháp Neighbor-joining (NJ). Lập cây phả hệ so sánh với các virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 2.3.2.1c A/Hong_Kong/6841/2010(H5N1) và A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014 (H5N6).
3.5.3. Phương pháp phân lập virus trên tế bào xơ phôi và trứng gà có phôi
Bệnh phẩm là dịch swab từ gà được lấy từ 3 chợ của tỉnh Quảng Nam được xử lý bằng cách lắc ống dịch swab có tăm bông bên trong, rồi ly tâm sau đó chuyển dịch nổi sang ống 1,5ml và vô khuẩn bằng kháng sinh.
Tiêm 0,2 ml dịch bệnh phẩm vào xoang niệu mô của phôi trứng gà, tiếp tục ấp ở nhiệt độ 370C đến 96 giờ, soi trứng hàng ngày, thu trứng chết và kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà và phản ứng HI với kháng thể chuẩn kháng vius cúm gia cầm và kháng thể kháng virus Newcastle để giám định virus phân lập được.
Phôi trứng được giữ ở tủ mát 2- 80C ít nhất 2 giờ trước khi thu hoạch dịch niệu mô. Dùng syring 5ml hoặc 10ml thu dịch niệu mô bằng cách đâm xuyên qua nắp buồng hơi. Dịch niệu mô được chia thành nhiều ống nhỏ (0,5ml/ống) giữ ở nhiệt độ -700C.
3.5.4. Xác định chỉ số EID50
Để tính EID50, virus được pha loãng thành nhiều nồng độ theo cơ số 10 và