Sử dụng môi trường tế bào xơ phôi chế từ phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi
để chuẩn độ virus cúm gia cầm. Tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng (lượng tế bào là 5x 104 tế bào/100 µl/ giếng). Virus được pha loãng theo các nồng độ 10-2- 10-8 với môi trường Eagle´s MEM, mỗi nồng độ 5 giếng, mỗi giếng 100µl dung dịch virus đã pha loãng ở các nồng độ đã xác định và quan sát CPE sau 2 ngày.
Sử dụng công thức Reed- Meunch để xác định chỉ số EID50. 3.5.6. Phương pháp Reed- Meunch
Bảng 3.5. Bảng tổng hợp số liệu để tính toán chỉ số EID50 và TCID50
Độ pha loãng bao gồm cả độ pha loãng có 100% nhiễm virus (HA dương tính) và độ
pha loãng không nhiễm virus (HA
âm tính) Số trứng bị nhiễm virus (HA dương tính) Số trứng không nhiễm virus (HA âm tính) Số tích lũy (cộng dồn) Tỷ lệ nhiễm virus Nhiễ m virus (A) Khôn g nhiễ m (B) Tổng cộng (A+B) A/(A+ B)x 100 10-1 - ↑ ↓ 10-2 - ↑ ↓ ... - ↑ ↓ ... - ↑ ↓ 10-8 - ↑ ↓
Công thức tính như sau:
Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%-50 Chỉ số =
Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%- Tỷ lệ nhiễm cận dưới 50%
Giá trị EID50 và TCID50 được tính ở hiệu giá pha loãng cận trên 50% cộng với chỉ số tính đuọc ở trên. Ví dụ nếu tính được chỉ số là 0,5 với độ pha loãng virus cao nhất có tỷ lệ nhiễm 50% là 10-7, thì chuẩn độ của virus sẽ là 10-7,5.
3.5.7. Phương pháp HA, HI giám định virus
3.5.7.1. Phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA)
Phương pháp HA được tiến hành phản ứng trên đĩa microtier 96 giếng đáy chữ v (tổng lượng hỗn dịch là 75µl/ giếng), các bước tiến hành như sau:
- Cho 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 vào các giếng của đĩa phản ứng. - Cho 25 µl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt đầu pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2 từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11. - Nhỏ 25 µl dung dịch PBS vào các giếng từ 1 đến giếng 12.
- Nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà tống khỏe mạnh) vào các giếng từ 1 đến giếng 12. Để 15- 30 phút ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả ngưng kết.
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết toàn phần.
3.5.7.2. Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phương pháp HI cũng được tiến hành trên đĩa microtiter 96 giếng đáy chữ V. Sau khi đã biết hiệu giá HA của virus, virus được pha thành dung dịch kháng nguyên có chứa 4 đơn vị HA, các bước tiến hành phản ứng như sau: - Cho 25 µl dung dịch PBS pH 7,2 vào các giếng của đĩa phản ứng.
- Cho 25 µl kháng huyết thanh chuẩn A/H5N1, A/H5N6 đã biết được pha loãng với PBS theo cơ số 2.
- Sau đó nhỏ vào mỗi giếng 25 µl dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị HA, để ở nhiệt độ phòng 30 phút.
- Tiếp tục nhỏ 25 µl dung dịch hồng cầu gà 1% vào các giếng, để 15-30 phút và đọc kết quả.
Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh còn có hiện tượng ức chế hoàn toàn ngưng kết hồng cầu.
Khi tiến hành phản ứng HI với kháng huyết thanh chế từ chồn (ferret), huyết thanh được pha loãng trước ở 1/10, rồi tiếp tục pha theo cơ số 2.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. TÌNH HÌNH CHĂN NUÔI GIA CẦM TẠI TỈNH QUẢNG NAM
Tỉnh Quảng Nam nằm ngay giữa miền Trung Việt Nam, trong vùng kinh tế trọng điểm miền Trung gồm Thừa Thiên - Huế, Đà Nẵng, Quảng Nam, Quảng Ngãi, là địa phương có nhiều tiềm năng, cơ hội lớn để phát triển mạnh mẽ. Quảng Nam gồm 18 huyện và thành phố (2 thành phố, 16 huyện). Quảng Nam là tỉnh có ngành chăn nuôi khá phát triển đặc biệt là chăn nuôi gia cầm.
Hình 4.1. Bản đồ tỉnh Quảng Nam
Nguồn: http://vpubnd.quangnam.vn/Default.aspx?tabid=133
Theo Chi cục Chăn nuôi -Thú y tỉnh Quảng Nam đến giữa tháng 3 năm 2017 toàn tỉnh có đàn gia cầm hơn 6,2 triệu con. Với tổng đàn gia cầm là khá cao nhưng bên cạnh đó cũng còn tồn tại không ít các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, phần lớn người dân thả nổi khâu vệ sinh chuồng trại, phun tiêu độc khử trùng, đặc biệt là bỏ lửng việc tiêm vắc xin phòng bệnh cho vật nuôi. Vì thế, tại nhiều nơi
hay tái bùng phát dịch cúm gia cầm nguy hiểm, gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế và ảnh hưởng lớn đến đời sống xã hội.
Để phòng chống bệnh CGC, hàng năm Chi cục Thú y tỉnh Quảng Nam tổ chức hai đợt tiêm vắc xin phòng bệnh cho đàn gà, vịt. Đợt 1 từ tháng 6 và đợt 2 từ tháng 7 đến tháng 12. Ngoài ra, các tháng còn lại, tiêm bổ sung cho đàn gia cầm chưa đến tuổi tiêm phòng hoặc đàn còn bỏ sót trong đợt tiêm chính, đàn hết thời gian miễn dịch bảo hộ và đàn nuôi mới. Loại vắc xin đang được sử dụng là vắc xin Navet-Vifluvac (Công ty Navetco).
4.2. CHẨN ĐOÁN CÚM A/H5N1, A/H5N6 4.2.1. Chẩn đoán virus cúm týp A 4.2.1. Chẩn đoán virus cúm týp A
Các nghiên cứu cho thấy gia cầm và đặc biệt là thủy cầm mặc dù mang mầm bệnh nhưng không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng và thường xuyên bài thải mầm bệnh ra môi trường gây cảm nhiễm cho các động vật cảm thụ khác. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành lấy mẫu dịch hầu họng của gia cầm gồm gà và vịt. Mẫu được lấy tại 3 chợ của tỉnh Quảng Nam là Điện Bàn, Núi Thành, Phú Ninh với cơ cấu lấy mẫu là 30 gà và 60 vịt mỗi chợ. Đây là các chợ thuộc các huyện đã xảy ra dịch cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6 năm 2016- 2017. Các mẫu được xét nghiệm sàng lọc virus cúm type A theo phương pháp rRT-PCR theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN8400-26:2014. Kết quả xét nghệm được trình bày ở bảng 4.1 và hình 4.2.
Bảng 4.1. Kết quả xét nghiệm virus cúm A
Tên chợ (Huyện) Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính virus cúm A Tỷ lệ mẫu dương tính virus cúm A (%) Điện Bàn 360 19 5,28 Núi Thành 360 64 17,78 Phú Ninh 360 30 8,33 Tổng cộng 1080 113 10,46
Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy: Mặc dù gà, vịt buôn bán tại các chợ gia cầm sống là các gia cầm khỏe mạnh không có biểu hiện lâm sàng của bệnh CGC nhưng vẫn mang virus cúm A. Trong tổng số 1080 mẫu được xét nghiệm sàng lọc virus cúm A có 113 mẫu dương tính, chiếm tỷ lệ 10,46%. Trong đó cao nhất là tại chợ Núi Thành với 17,78 %, tiếp theo là chợ Phú Ninh 8,3 %, chợ
Điện Bàn thấp nhất 5,28% là dương tính với cúm A. Kết quả này thấp hơn so với kết quả giám sát tại 14 tỉnh của Cục Thú y các năm từ 2011 đến 2013 với tỷ lệ gia cầm dương tính với virus cúm A là 22,1% (tổng số 2162/ 9790 mẫu dương tính) (Nguyen D. T. và cs., 2014). Nguyên nhân có thể là do đợt giám sát trên là xét nghiệm dựa trên mẫu gộp (5 mẫu gộp thành 1 mẫu xét nghiệm) do đó 1 mẫu trong 1 mẫu dương tính có thể cho kết quả dương tính. Đồng thời trong các giai đoạn nghiên cứu trên bệnh cúm gia cầm vẫn xảy ra rải rác trong cả nước, trong khi đó trong năm 2016, Quảng Nam không xảy ra bùng phát ổ dịch cúm gia cầm (Cục Thú y, 2016).
Hình 4.2. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A
Việc lưu hành virus CGC tại các chợ buôn bán gia cầm sống là một yếu tố nguy cơ lây lan bệnh CGC. Thủy cầm hoang dã, bao gồm cả vịt là những bể chứa tự nhiên của virus CGC type A và đóng vai trò quan trọng trong sinh thái và truyền bệnh của virus. Virus CGC ở các loài thủy cầm ở trạng thái cân bằng, các vật chủ nhiễm virus thường không biểu hiện các triệu chứng lâm sàng. Ở vật chủ, virus CGC nhân lên ở đường tiêu hóa được bài thải với mật độ cao trong phân và lan truyền thông qua đường phân-miệng. Từ bể chứa là các thủy cầm này virus có thể truyền cho các gia cầm và động vật có vú khác bao gồm cả con
người và có thể gây các đợt bùng phát dịch bệnh nghiêm trọng (Sturm-Ramirez
et al., 2005).
Chợ buôn bán gia cầm sống là một đường lây truyền virus cúm quan trọng (Nina et al., 2007). Với đặc điểm là tập trung nhiều loại gia cầm khác nhau, được cung cấp bởi nhiều nguồn khác nhau khiến chợ buôn bán gia cầm sống có vai trò trong quá trình nhân lên, duy trì, tuần hoàn và lan truyền virus CGC (Cardona et al., 2009; Chu et al., 2016).
Do đó, việc tiếp tục giám sát virus CGC tại các chợ buôn bán gia cầm sống giúp hiểu rõ hơn sự phân bố của virus CGC và để giảm thiểu nguy cơ cho sức khỏe cộng đồng. Có thể thực hiện một số biện pháp để kiểm soát virus CGC tại các chợ như đóng cửa chợ tạm thời, tăng cường vệ sinh, khử trùng tại các chợ, giảm số gia cầm lượng buôn bán theo quý, cấm lưu giữ gia cầm qua đêm ở chợ,… Các biện pháp này đã chứng minh là có hiệu quả trong việc giảm sự lưu hành vius cúm tại các chợ buôn bán (Offeddu et al., 2016).
4.2.2. Chẩn đoán virus cúm A/H5
Sau khi sàng lọc cúm gia cầm type A, các mẫu dương tính được tiếp tục định subtype H5 bằng phương pháp rRT-PCR. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2, hình 4.3 và hình 4.4.
Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm cúm A/H5
Địa điểm Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính với type A Số mẫu dương tính với A/H5 Tỷ lệ dương tính với A/H5/ tổng số mẫu Tỷ lệ dương tính với A/H5/số mẫu dương tính với type A Điện Bàn 360 19 3 0,83 15,79 Núi Thành 360 64 9 2,5 14,06 Phú Ninh 360 30 9 2,5 30 Tổng cộng 1080 113 21 1,94 18,58
Trong tổng số 1080 mẫu xét nghiệm có 21 mẫu có gen H5 đặc trưng cho virus cúm A/H5, chiếm 1,94%, thấp hơn các nghiên cứu giám sát của Cục Thú y thực hiện hàng năm trước đây. Các đợt giám sát virus CGC trên đàn vịt đã được thực hiện từ năm 2007 đến năm 2009, trong 5 đợt giám sát virus với tổng số 2571 mẫu swab được thu thập từ thủy cầm, có 151 mẫu dương tính với gen H5, chiếm tỷ lệ 5,87% (Phan và cs., 2013).
Chương trình giám sát CGC giai đoạn 2011 – 2013 tại 14/63 tỉnh thành phố trong cả nước cho thấy: Trong tổng số 9790 mẫu được kiểm tra, 531 mẫu dương tính với virus cúm A/H5 (chiếm tỷ lệ 5,4%) (Nguyen D. T. và cs., 2014).
0.83 2.5 2.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Điện Bàn Núi Thành Phú Ninh
Địa điểm Tỷ lệ(%)
Hình 4.3. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5/số mẫu xét nghiệm
Tỷ lệ(%) 15,79 14,06 30 0 5 10 15 20 25 30 35
Điện Bàn Núi Thành Phú Ninh
Địa điểm
Mặc dù chợ Phú Ninh có tỷ lệ mẫu có gen M5 thấp hơn Núi Thành nhưng 2 chợ này lại có tỷ lệ mẫu dương tính với gen H5 là bằng nhau (2,5%). Chợ Điện Bàn là chợ có số mẫu dương tính cúm A thấp nhất, chiếm tỷ lệ 0,83%.
Virus cúm A/H5 là những chủng virus có khả năng có độc lực cao. Việc lưu hành virus cúm tại Quảng Nam có thể là nguy cơ bùng phát dịch trong thời gian tới đặc biệt là các chợ Núi Thành và chợ Phú Ninh. Do đó cần tăng cương công tác tiêu độc khử trùng đồng thời nghiên cứu xác định rõ các chủng virus cúm A/H5 này để có biện pháp phòng chống bệnh.
Kết quả cũng cho thấy, trong 113 mẫu dương tính với M chỉ có 21 mẫu dương tính với gen H5, chiếm tỷ lệ 18,58%. Trong đó có chợ Phú Ninh với 30 mẫu dương tính với gen M nhưng số mẫu dương tính H5 là 9 mẫu( chiếm tỷ lệ 30%) là chợ có tỷ lệ dương tính với A/H5/số mẫu dương tính với typeA cao nhất. Sau đó đến chợ Điện Bàn với 3 mẫu (trong 19 mẫu dương M), chiếm 15,79% và mặc dù chợ Núi Thành có số mẫu dương tính với gen M là cao nhất( 64 mẫu), nhưng tỷ lệ dương tính với A/H5/số mẫu dương tính với type A chiếm tỷ lệ 14,06% thấp nhất so với Điện Bàn và Phú Ninh. Như vậy, bên cạnh virus cúm A/H5 có thể còn có nhiều subtype H khác cũng đang lưu hành trong đàn gia cầm.
Chu et al. (2016) khi nghiên cứu bệnh CGC tại tỉnh Thừa Thiên Huế thấy rằng có nhiều các subtype khác nhau lưu hành trong đàn gia cầm và môi trường tại các chợ buôn bán gia cầm sống. Trong 178 mẫu virus cúm A phân lập được có các subtype H3 (19 virus), H4 (2), H5 (8), H6 (30), H9 (114) và H11 (5). Cụ thể hơn là H3N2 (18 virus), H3N6 (1), H4N6 (2), H6N2 (14), H6N6 (16), H9N2 (109), H9N6 (5), H11N6 (1) và H11N7 (4).
4.2.3. Chẩn đoán virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Trong nghiên cứu này chúng tôi chỉ tập trung vào xét nghiệm virus cúm A/H5N1. Mẫu được xác định là dương tính với virus cúm A/H5N1, A/H5N6 khi dương tính cúm A, dương tính gen H5 và dương tính gen N1, N6. Do đó, các mẫu dương tính với virus cúm A/H5 tiếp tục được xác định gen N1 bằng phương pháp rRT-PCR để xác định virus cúm A/H5N1, A/H5N6. Kết quả được trình bày ở bảng 4.3, hình 4.5 và hình 4.6:
Bảng 4.3. Kết quả xét nghiệm virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 Địa điểm Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương tính A/H5 Số mẫu dương tính N1 Số mẫu dương tính N6 Tỷ lệ dương tính A/H5N1 /tổng số mẫu Tỷ lệ dương tính A/H5N1 /số mẫu dương tính cúm A/H5 Tỷ lệ dương tính A/H5N6 /tổng số mẫu Tỷ lệ dương tính A/H5N6 /số mẫu dương tính cúm A/H5 Điện Bàn 360 3 0 2 0 0 0,56 66,67 Núi Thành 360 9 0 6 0 0 0,56 66,67 Phú Ninh 360 9 3 5 0,83 33,33 1,39 55,56 Tổng cộng 1080 21 3 13 0,28 14,29 1,20 61,90
Hình 4.6. Tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1, A/H5N6/số mẫu dương tính virus cúm A/H5
Kết quả bảng 4.3, hình 4.5 và hình 4.6 cho thấy: Trong 1080 mẫu xét nghiệm có 13 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N6, chiếm tỷ lệ 1,2%. Trong đó cao nhất là tại Phú Ninh với 1,39%, tiếp theo là chợ Núi Thành và Điện Bàn đều là 0,56%. Với cúm A/H5N1 có 3 mẫu chiếm tỷ lệ 0,28%. Phú Ninh có 3 mẫu dương tính với A/H5N1 chiếm tỷ lệ 0,83%, và không phát hiện được virus cúm A/H5N1 tại Núi Thành và Điện Bàn.Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1 này thấp hơn các nghiên cứu giám sát của Nguyen et al. (2014) với tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 là 3,9 % trong các năm 2011-2013. Kết quả nghiên cứu lưu hành virus cúm A/H5N1 từ 2007 đến 2009 tại các chợ ở một số tỉnh thuộc đồng bằng sông Cửu Long cũng cho kết quả cao hơn với tỷ lệ dương tính virus cúm A/H5N1 là 6,6 % (Phan et al., 2013).
Virus cúm A/H5N1 là virus có độc lực cao, lưu hành tại Việt Nam từ cuối năm 2003 đã gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng và ảnh hưởng tới sức khỏe cộng đồng. Chợ buôn bán gia cầm được xác định là nguồn gây bệnh H5N1 cho người (Wan et al., 2011). Yu et al. (2007) cũng đã xác định phần lớn các người mắc bệnh trong vùng nội thành ở Trung Quốc từ 2005 đến 2006 không tiếp xúc
với gia cầm ốm, gia cầm chết nhưng đều có đến các chợ buôn bán gia cầm sống trước khi bị bệnh.
Các gia cầm mang virus cúm có thể bài thải virus ra ngoài môi trường, tích trữ qua nhiều ngày tại các chợ, từ đó có thể lây truyền cho người và nhiều động vật khác, thậm chí còn có thể lây nhiễm ra các trang trại thông qua sự di chuyển của người buôn bán gia cầm. Bởi phần lớn người buôn bán đi vào những trang trại bằng phương tiện của họ và tự bắt gia cầm mà không có bất kỳ biện pháp an toàn sinh học nào có thể dẫn đến tự lây lan từ đàn gia cầm này