Trong tổng số1080 mẫu được tiến hành chiết tách RNA bằng kít RNeasy minikit và xét nghiệm bằng phản ứng PCR phát hiện 113 mẫu dương tính virus cúm A. Những mẫu dương tính cúm A tiếp tục xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR để phát hiện cúm H5N1, H5N6. Kết quả cho thấy 3/113 mẫu dương tính với H5N1 (chiếm 0,83%), 13/113 mẫu dương tính với H5N6 (chiếm 1,2%). Các mẫu dương tính A/H5N1, A/H5N6 được tiếp tục gây nhiễm lên phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi, kết quả là đã phân lập được 2 chủng virus cúm A/H5N1 trên tổng số 3 mẫu phát hiện dương tính cúm A/H5N1. Cả 2 chủng này đều thuộc Phú Ninh. Mẫu còn lại và các mẫu dương tính A/H5N6 không phân lập được virus có thể do virus có trong mẫu swab đã chết trong quá trình bảo quản và vận chuyển. Kết quả xét nghiệm được trình bày ở bảng 4.9.
Bảng4.9: Kết quả xét nghiệm và phân lập virus
Địa điểm
Số mẫu
Kết quả xét nghiệm (rRT-PCR) Phân lập Dương tính cúm A Dương tính H5N1 Dương tính H5N6 Dương tính H5N1 Dương tính H5N6 Số mẫu Tỷ lệ(%) Số mẫu Tỷ lệ(%) Số mẫu Tỷ lệ(%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ(%) Điện Bàn 360 19 5,28 0 0 2 0,56 0 0 0 0 Núi Thành 360 64 17,78 0 0 6 0,56 0 0 0 0 Phú Ninh 360 30 8,33 3 0,83 5 1,39 2 0,56 0 0 Tổng 1080 113 10,46 3 0,83 13 1,2 2 0,56 0 0
Từ kết quả xét nghiệm và phân lập virus cho thấy việc tiến hành giám sát virus CGC là rất cần thiết với bằng chứng rõ ràng về virus đã phát hiện và phân lập được. Điều này giúp cho việc có thông tin chủ động trong việc phát
hiện sớm những nguy cơ dịch CGC có thể xảy ra, chủ động nâng cao công tác phòng và chống bệnh CGC.
4.3.2. Tính thích ứng trên phôi gà (xác định chỉ số EID50 )
Virus cúm nói chung và virus CGC A/H5N1 độc lực cao có khả năng phát triển tốt trên phôi gà, vì vậy phôi gà 9- 10 ngày tuổi thường được sử dụng để phân lập CGC độc lực cao trong công tác chẩn đoán cũng như để giữ gống virus. Tuy nhiên, các chủng virus CGC có đặc điểm khác nhau thì khi nhân lên trên phôi trứng, thể hiện bằng sự gây nhiễm phôi, gây chết phôi và chuẩn độ tối ưu của các chủng virus khác nhau là khác nhau. Virus có độc lực thấp thường giết chết phôi trứng chậm hơn. Để xác định đặc tính thích ứng của 2 chủng virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1073/2017 = Mẫu1, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-071/2017= Mẫu2 trên phôi gà.
Chúng tôi tiến hành:
Phôi trứng được lấy từ đà gà khỏe mạnh chưa tiêm vắc xin CGC H5N1 và không nhiễm virus CGC trong tự nhiên để tránh tác động nếu có của kháng thể từ gà mẹ được tiêm phòng. Trứng được mua từ 8 ngày tuổi và ấp tiếp1 ngày để ổn định tại phòng thí nghiệm trước khi sử dụng cho thí nghiệm xác định sự thích nghi của chủng virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2- 1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 trên phôi gà. Chủng virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 được chia làm các ống nhỏ sau khi phân lập và giữ ở nhiệt độ -860C. Trước khi tiến hành thí nghiệm hỗn dịch virus đã được kiểm tra vô trùng theo thường quy và được pha thành nhiều nồng độ từ 10-1-10-8 bằng dung dịch đệm PBS có pH 7,2. Tiến hành gây nhiễm cho phôi trứng với 6 nồng độ từ 10-3-10-8 vào xoang niệu mô của phôi trứng, mỗi nồng độ gây nhiễm cho 5 phôi với liều là 100µl/ phôi, ấp ở nhiệt độ 370C, theo dõi 2 lần/ ngày cách nhau khoảng 8 giờ trong vòng 4 ngày, loại phôi chết trước 24 giờ. Trong thí nghiệm này có sử dụng 3 phôi trứng tiêm dung dịch PBS làm đối trứng âm và ấp trong cùng điều kiện.
Các phôi trứng chết trong thời gian theo dõi được làm lạnh ở nhiệt độ 2- 80C trong vòng 24 giờ mạch máu co lại và tiến hành thu hoạch dịch niệu mô.
Những phôi trứng sống sau thời gian theo dõi cũng được thu dịch niệu mô và được kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định khả năng nhiễm của virus trên phôi trứng và xác định chỉ số EID50 theo công thức Reed-Muench.
Bảng 4.10. Kết quả thời gian gây chết phôi
Mẫu
Số phôi gây nhiễm
Theo dõi số phôi chết Tổng số phôi chết Tỷ lệ (%) 0-24h 25-48h 49-72h 73-96h Mẫu1 30 0 10 5 5 20 67 Mẫu2 30 0 10 5 4 19 63
Kết quả bảng 4.10 cho thấy: Không có phôi nào chết trước 24 giờ, virus bắt đầu giết chết phôi trong vòng 2 ngày từ sau khi gây nhiễm. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đây (Wanasawaeng và cs, 2009) nhận xét rằng virus độc lực cao thường giết chết phôi trứng trong vòng 48 giờ sau khi gây nhiễm lên xoang niệu mô.
Bảng 4.11. Kết quả theo dõi tỷ lệ sống/ chết của phôi trứng khi gây nhiễm virus mẫu1, mẫu2.
Mẫu HG pha loãng Số phôi gây nhiễm Số phôi bị nhiễm Số phôi không nhiễm Số tích lũy Tỷ lệ nhiễm virus (%) A/ (A+B) Nhiễm virus (A) Không nhiễm virus (B) Tổng cộng(A+B) Mẫu1 10-3 5 5 0 20 0 20 100 10-4 5 5 0 15 0 15 100 10-5 5 5 0 10 0 10 100 10-6 5 4 1 5 1 6 83,3 10-7 5 1 4 1 5 6 16,7 10-8 5 0 5 0 10 10 0 ĐC (-) 3 0 3
EID50 /0,1ml 107 (theo công thức Reed- Muench)
Mẫu2 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 3 2 4 1 5 80 10-7 5 1 4 1 5 6 16,7 10-8 5 0 5 0 10 10 0 ĐC (- ) 3 0 3 6,9
Ở nồng độ 10-3, toàn bộ phôi trứng (mẫu1, mẫu2) chết trong vòng 40 giờ sau khi gây nhiễm.
Ở nồng độ 10-4, toàn bộ số phôi trứng chết trong ngày thứ 2, trong khoảng 40-48 giờ sau nhiễm.
Ở nồng độ 10-5 cũng giết chết toàn bộ phôi trứng nhưng trong thời gian lâu hơn ở nồng độ 10-3 và 10-4, nhưng cũng không quá 72 giờ kể từ khi nhiễm. Ở nồng độ 10-6 có phôi thường chết trong 72-96 giờ. Ở độ pha loãng này mẫu1 có 1 phôi sống, mẫu2 còn 2 phôi còn sống. Như vậy, ở nồng độ này thường vẫn có 1-2 phôi vẫn sống.
Nồng độ pha loãng cao nhất gây chết phôi là 10-7, tuy nhiên chỉ có 1/5 phôi chết ở thời điểm 96 giờ và 4 phôi vẫn còn sống ở cả mẫu1và mẫu2 . Ở nồng độ cao nhất 10-8, toàn bộ số phôi đều sống bình thường.
Đối chứng âm: các phôi vẫn sống khỏe mạnh bình thường.
Để xác định khả năng gây nhiễm phôi trứng của virus chúng tôi thu dịch niệu mô của toàn bộ số phôi chết và sống kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu (HA) gà.
Chỉ dịch niệu mô từ trứng chết mới có khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà với hiệu giá HA là 8-9log2, còn dịch niệu mô của trứng sống không gây ngưng kết hồng cầu gà.
Bên cạnh việc kiểm tra đặc tính gây ngưng kết hồng cầu, chúng tôi mổ trứng, thu phôi để kiểm tra bệnh tích phôi. Toàn bộ số phôi chết đều có triệu chứng xuất huyết lan tràn, phôi còi cọc, phát triển kém. Phôi đối chứng phát triển bình thường.
Kết quả cho thấy cả 2 virus cúm này có khả năng thích ứng và phát triển tốt trên phôi trứng (kết quả tính chuẩn độ của virus cúm mẫu1 và mẫu2 lần lượt là: 107 EID50 và 106,9 EID50 đối với liều gây nhiễm là 100µl). Chuẩn độ của 2 virus trên môi trường phôi trứng gà là 108 EID50/ml và 107,9 EID50/ml.
4.3.3. Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà (chỉ số TCID50)
Bên cạnh việc xác định tính thích ứng trên phôi trứng gà thì chúng tôi cũng tiến hành song song việc xác định tính thích ứng của virus này trên tế bào xơ phôi gà.
Phôi gà 8 ngày tuổi được kiểm tra khỏe mạnh, bình thường, mổ trứng để chế tế bào CEF. Tế bào được nuôi ở trai T75 và phát triển thảm và nuôi dưỡng bằng môi trường MEM với 5% huyết thanh thai bê. Tách tế bào CEF từ chai T75 và chuyển sang đĩa nuôi cấy 96 giếng để tiến hành chuẩn độ.
Virus được pha loãng như khi chuẩn độ trên phôi gà và sử dụng ở nồng độ 10-2 -10-8 để chuẩn độ virus. Mỗi nồng độ virus đã pha loãng được nhiễm cho 5 giếng với lượng 100µl trên giếng. Đĩa tế bào được nhiễm virus nuôi trong tủ ấm 370C và 5% CO2. Nuôi tế bào trong vòng 5 ngày, theo dõi hàng ngày để quan sát bệnh tích (CPE) (bảng 4.12).
Bảng 4.12. Kết quả theo dõi virus gây nhiễm lên tế bào CEF
Mẫu
Số giếng gây nhiễm
Theo dõi số giếng có CPE Tổng số có CPE Tỷ lệ (%) 0-24h 25-48h 49-72h 73-96h Mẫu1 30 0 10 14 0 24 80 Mẫu2 30 0 10 14 0 24 80
Từ nồng độ 10-2-10-5 toàn bộ các giếng của mẫu1 và mẫu2 đều có CPE và thảm tế bào đã bị virus phá hủy trong vòng 24-72 giờ.
Ở nồng độ pha loãng 10-6 mẫu1 có 2 giếng có CPE, còn ở mẫu2 có 4 giếng có CPE.
Ở nồng độ pha loãng 10-7 chỉ có 2 giếng nhiễm virus ở mẫu1, mẫu2 không có giếng nào nhiễm virus.
Ở nồng độ pha loãng 10-8 cả 2 mẫu đều không có giếng tế bào nào có hiện tượng thảm tế bào bị phá hủy, không có CPE, tức là không có hiện tượng nhiễm virus.
Bảng 4.13. Kết quả theo dõi bệnh tích tế bào trên CEF khi gây nhiễm virus mẫu1, mẫu2 Mẫu pha HG loãng Số giếng gây nhiễm Số giếng có CPE Số giếng không có CPE Số tích lũy Tỷ lệ nhiễm virus (%) A/ (A+B) Nhiễm virus (A) Không nhiễm virus (B) Tổng cộng(A+B) Mẫu1 10-2 5 5 0 24 0 24 100 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 2 3 4 3 7 57,1 10-7 5 2 3 2 6 8 25 10-8 5 0 5 0 11 11 0 ĐC (-) 5 0 5 TCID50 /0,1ml 106,2 Mẫu2 10-2 5 5 0 24 0 24 100 10-3 5 5 0 19 0 19 100 10-4 5 5 0 14 0 14 100 10-5 5 5 0 9 0 9 100 10-6 5 4 1 4 1 5 80 10-7 5 0 5 0 6 6 0 10-8 5 0 5 0 11 11 0 ĐC (-) 3 0 5 TCID50 /0,1ml 106,4
Với kết quả chuẩn độ virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5- QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 thực hiện trên tế bào CEF, chúng tôi nhận thấy 2 virus này có thể thích nghi phát triển trên môi trường tế bào CEF (kết quả tính chuẩn độ của virus cúm mẫu1 và
mẫu2 lần lượt là: 106,2TCID50 và 106,4TCID50 đối với liều gây nhiễm là 100µl). Chuẩn độ của 2 virus trên môi trường tế bào CEF là 107,2TCID50/ml và
107,4TCID50/ml.
Như vậy, với kết quả chuẩn độ của cả 2 virus trên 2 môi trường nuôi dưỡng này là có hiệu giá khá tương đồng với nhau: 108 EID50/ml và 107,9 EID50/ml,
107,2TCID50/ml và 107,4TCID50/ml.
Song song với việc sử dụng tế bào xơ phôi gà (CEF-chicken embrio Fibroblast), chúng tôi cũng sử dụng tế bào xơ phôi vịt (DEF-Duck embrio Fibroblast) và tế bào xơ phôi ngan (MDEF-Muscovy Duck embrio Fibroblast) tiến hành việc gây nhiễm và chuẩn độ cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD- 16H5-QN2-1073/2017, A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017. Kết quả cho thấy 2 virusnày cũng có thể nhiễm và phát triển tốt trên 2 loại tế bào DEF, MDEF (kết quả chi tiết không trình bày). Ngoài ra, virus cúm A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1073/2017,
A/Dk/VN/QuangNam/NCVD-16H5-QN2-1071/2017 cũng phát triển tốt trên môi trường tế bào dòng MDCK mà không cần xử lý tripsine TPCK.
Hình 4.13. Hình ảnh tế bào CEF khi phân lập và chuẩn độ virus
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Từ những kết quả nghiên cứu đã thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
- Tỷ lệ dương tính với type A (gen M5) là 10,46 % nhưng tỷ tệ dương tính A/H5 chỉ 1,94 %, với subtype A/H5N1 chỉ 0,28 %, A/H5N6 là 1,2% . - Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5(2,92%), virus cúm A/H5N1(0,42%), A/H5N6 (1,81%) ở vịt cao hơn so với gà (ở gà không phát hiện được cúm A/H5). - Tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gia cầm tại các chợ (chợ Điện Bàn, Núi Thành, Phú Ninh) cao nhất vào khoảng thời gian từ tháng 11 đến tháng 2, tháng 6 và thấp nhất là vào khoảng từ tháng 7 đến tháng 9. - Vào thời điểm tiến hành nghiên cứu (6 tháng cuối năm 2016 đến 6 tháng đầu năm 2017), virus cúm A/H5N1, A/H5N6 phát hiện tại Quảng Nam thuộc subclade 2.3.2.1c và 2.3.4.4.b.
- Môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển nhân lên của virus CGC là trên môi trường phôi trứng gà và môi trường tế bào xơ phôi gà. Như vậy, với kết quả chuẩn độ của cả 2 virus trên 2 môi trường nuôi dưỡng này là có hiệu giá khá tương đồng với nhau: 108 EID50/ml và 107,9 EID50/ml, 107,2TCID50/ml và 107,4TCID50/ml.
5.2. KIẾN NGHỊ
Cần tiếp tục giám sát và tiến hành tìm hiểu thêm về các subtype HxNy lưu hành ở các chợ buôn bán gia cầm sống tại Quảng Nam để chủ động phòng chống bệnh có hiệu quả cao.
Tăng cường công tác giám sát chủ động, vệ sinh, tiêu độc, khử trùng,… tại các chợ buôn ban gia cầm đặc biệt là các chợ có mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1, A/H5N6.
Tiếp tục sử dụng vaccine theo khuyến cáo của Cục Thú y với virus CGC nhánh 2.3.2.1c và 2.3.4.4b.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài Liệu Tiếng Việt:
1. Ban chỉ đạo Quốc gia phòng chống bệnh cúm gia cầm (2005). Báo cáo tổng kết công tác 2 năm phòng chống dịch cúm gia cầm, Hội nghị tổng kết 2 năm phòng chống dịch cúm gà, ngày 18 tháng 4 năm 2005 , Hà Nội.
2. Bùi Quang Anh (2005). Báo cáo về dịch cúm gia cầm, Hội nghị kiểm kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu Á do FAO, OIE tổ chức, từ 23 – 2 tháng 2 năm 2005, thành phố Hồ Chí Minh.
3. Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004). Bệnh cúm gia cầm: lưu hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh. Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 69 -75. 4. Cục Thú y (2004). Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống. Nhà xuất
bản Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Cục Thú y (2016). Báo cáo kết quả công tác năm 2016 và kế hoạch năm 2017. 6. FAO (2016). Bài học kinh nghiệm 8 năm hoạt động hỗ trợ kỹ thuật tăng cương
ứng phó khẩn cấp với cúm gia cầm độc lực cao tại Việt Nam.
7. Lê Thanh Hoà (2004). Họ Orthomyxoviridae và nhóm virus cúm A gây bệnh cúm trên gà và người, Viện khoa học công nghệ.
8. Lê Thanh Hòa (2006). Y-sinh học phân tử (quyển 1). Nhà xuất bản Y học, Hà Nội.
9. Lê Văn Năm (2004). Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía bắc. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y. 11. tr. 86-90.
10. Nguyễn Đăng Thọ, Nguyễn Hoàng Đăng, Đỗ Thị Hoa Đàm Thị Vui, Nguyễn Thị Điệp Mai Thùy Dương, Nguyễn Viết Không và Tô Long Thành. (2016). Virus cúm gia cầm độc lực cao H5N6 ở Việt Nam năm 2014. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y. 13 (1). tr. 18-28.
11. Nguyễn Tiến Dũng (2004). Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Năm năm 2003-2004. Khoa học kĩ thuật Thú y. 11. tr. 6-14.
12. Tô Long Thành (2004). Thông tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các nước Châu Á. Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 11(4). tr. 87- 93. 13. Tô Long Thành (2006). Thông tin cập nhật về cúm gia cầm và vacxin phòng
14. Tống Xuân Độ (2009). Giám sát sự lưu hành virus cúm A/H5N1 và đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine cúm gia cầm tại địa bàn tỉnh Quảng Ninh. Luận văn thạc sỹ Nông nghiệp. Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, tr. 69.