Phần 3 Nội dun g nguyên liệu phương pháp nghiên cứu
3.5. Phương pháp nghiên cứu
3.5.1. Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, A/H5N6
3.5.1.1. Phương pháp tách chiết ARN
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARN bằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200 l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 l Qiagen buffer RLT có 1 % -ME, lắc đều trên máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Thêm 500 l etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ.
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng.
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc.
- Nhỏ 500 l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer.
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu.
- Đặt cột lọc vào ống thu ARN, nhỏ 50 l nước sạch nuclease vào cột lọc, ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm ở tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ cột lọc, giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR. Nếu để sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm 20oC hoặc nhiệt độ thấp hơn.
3.5.1.2. Phương pháp Real time RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Thực hiện phản ứng Real time RT-PCR (rRT-PCR) sử dụng các cặp mồi và probe (Bảng 3.1) được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, A/H5N6 (theo quy trình chẩn đoán – TCVN 8400-26:2014).
Bảng 3. 1. Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6
Mồi/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu 5’ 3’
M
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1 Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA H5
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1 Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC N1
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1
Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C N6
Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGC CCA GAC CC FAM BHQ1 Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG
Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC
Trong đó
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2. Thành phần của phản ứng Real time RT-PCR
Hỗn hợp phản ứng Lượng dùng cho 1 phản ứng (µl) 2x Reaction buffer 12,5 Mồi xuôi 20 μM 0,5 Mồi ngược 20 μM 0,5 Taqman probe 6 μM 0,5 Enzyme mix 0,5 Nước cất sạch nuclease 5,5 Mẫu ARN 5,0
- Chu trình nhiệt của phản ứng: + 1 vòng ở 50 oC trong 15 phút + 1 vòng ở 95 oC trong 2 phút
+ Chu trình 40 vòng: 95 oC trong 10 giây + 58 oC trong 50 giây.