Phần 3 Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4 Phƣơng pháp qu n sát các triệu chứng sàng
Chúng tôi tiến hành theo d i, quan sát bằng cách quay phim, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể trên đàn gà nghi mắc ORT; sau đ ghi ch p các triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc ORT c n sống: ủ rũ, gà ngáp kh thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi c dịch viêm, đau mắt,...
3.4 Phƣơng pháp ổ há
Với những gia cầm c triệu chứng r ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y. Gà đƣợc cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dƣới, bộc lộ các cơ quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể; lƣu lại hình ảnh bệnh tích đặc trƣng làm cơ sở cho việc báo cáo.
- Nếu gia cầm c n sống phải d ng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích d ng điện, cắt tiết, .
- iểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các l tự nhiên, khớp, ngoại k sinh tr ng và các tổn thƣơng,
- ổ khám kiểm tra nội tạng bên trong.
- Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh ph m. - Xử l tiêu độc xác gia cầm.
3.4 Phƣơng pháp y u và bảo quản u à tiêu bản
ẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng v ng tổn thƣơng điển hình, lấy đủ đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lƣợng cần thiết .
ẫu c thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi.
i i h ngoáy m i à h ngoáy h h ng d ng tăm bông vô tr ng ngoáy sâu vào l mũi/hầu họng của gà bệnh đã đƣợc vi trùng bề mặt bằng cồn 70o, để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bông, sau đ để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trƣờng vận chuyển Stuart Transport edium , môi trƣờng nƣớc thịt vô tr ng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đƣa về ph ng thí nghiệm sau 2-8 giờ. Nếu ở xa ph ng thí nghiệm thì môi trƣờng vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh ph m phải đƣợc cấy vào môi trƣờng phân lập thích hợp.
i i h h q n h y h ph q n: d ng k o vô tr ng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đ d ng tăm bông vô tr ng đƣa dọc theo đƣờng ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trƣờng nhƣ trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển đến ph ng thí nghiệm.
i i m à t h ph i: sau khi mổ khám gà, d ng k o vô tr ng cắt lấy tổ chức phổi ở v ng định x t nghiệm.
i i m à t h nh há ruột, hạch phổi, làm tƣơng tự nhƣ lấy mẫu tổ chức phổi.
3.4.4. Phƣơng pháp nu i c y và ph n ập vi hu n
Phân lập vi khu n là việc tách riêng vi khu n từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đƣa vi khu n về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đƣợc tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu c nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng các phƣơng pháp phân lập đƣợc vi khu n thuần khiết để từ đ xác định một số đặc điểm sinh vật, h a học gây bệnh của vi khu n.
1: Cấy mẫu bệnh ph m nghi chứa vi khu n lên trên môi trƣờng thạch máu Columbia đã chu n bị từ trƣớc bổ sung 5-10% máu thỏ hoặc máu cừu và 10 g/ml Gentamicine).
2: đĩa môi trƣờng trong tủ ấm 37o
C, CO2 5% trong thời gian từ 24-72 giờ.
3: ựa chọn những khu n lạc nghi cấy chuyển sang môi trƣờng tƣơng tự.
4: đĩa môi trƣờng trong tủ ấm 37oC, CO2 5% trong thời gian từ 24-72 giờ.
5: ựa chọn những khu n lạc trên môi trƣờng thử phản ứng Catalase, Oxidase,
6: Cấy chuyển những khu n lạc trên sang môi trƣờng BHB môi trƣờng dinh dƣỡng máu tim .
7: đĩa môi trƣờng trong tủ ấm 37oC, CO2 5% trong thời gian từ 24-72 giờ.
8: Thử phản ứng Indol.
c 9: Giữ giống trong môi trƣờng có bổ sung 15 – 20% Glycerol, bảo quản trong tủ lạnh -860C.
Phƣơng pháp nhuộm Gram
Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khu n Gram dƣơng s giữ đƣợc phức hợp tím gentians không bị t y màu bởi cồn-axeton, trong khi vi khu n Gram âm không giữ đƣợc phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khu n Gram dƣơng vẫn giữ đƣợc màu tím Gentian còn vi khu n Gram âm bắt màu hồng của Fucshin.
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản. Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nƣớc muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1-3 khu n lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nƣớc để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để vi khu n gắn chặt vào phiến kính và để vi khu n bắt màu đƣợc tốt hơn.
Bƣớc 2: nhuộm màu
- Nhỏ dung dịch tím Gentian để yên trong vòng 1 phút, rửa nƣớc. - Nhỏ dung dịch ugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nƣớc.
- Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, rửa nƣớc. - Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nƣớc, để khô. Quan sát hình thái vi khu n đƣợc nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100x.
3.4.6 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y , Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4.7 Phƣơng pháp PCR
3.4.7.1.Phương pháp chi t tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN QI GEN Inc., US để tách chiết DNA tổng số theo các bƣớc:
ước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
ước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. ở 70oC trong 30 phút.
ước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
ước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dƣới.
ước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới.
ước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dƣới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa nhƣ trên.
ước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khu n trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 l Buffer E, để ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút. Sau đ ly tâm 13000 v ng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dƣới, bảo quản ở -20oC.
3.4.7.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành ph n của phản ứng PCR: STT Nội dung Th tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
i i đoạn ƣ c Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
1 Du i mạch 94 5 phút 1
2
Du i mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3
Hoàn chỉnh 72 7 phút
1
Dừng phản ứng 4
3 4 7 3 Điện di kiểm tra sản ph m PCR
ước 1: Chu n bị thạch garose 1.2%: Cân 1.2g garose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong l vi s ng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 l Syber green, đổ thạch c số giếng tƣơng ứng số mẫu cần điện di.
ước 2: Chu n bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8l sản ph m RT-PCR
ước 3: Chu n bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
ước 4: Nhỏ marker và sản ph m PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6l maker 100bp và 10l sản ph m PCR m i giếng.
ước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
ước 6: Quan sát kết quả điện di sản ph m PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.4.8 Phương pháp iệ
Sử dụng phƣơng pháp thống kê sinh học, Excel, kiểm tra sự sai khác bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai một yếu tố (p<0,05)