3.4 Phƣơng pháp qu n sát các triệu chứng sàng
Chúng tôi tiến hành theo d i, quan sát bằng cách quay phim, chụp ảnh, ghi chép số liệu từng cá thể trên đàn gà nghi mắc ORT; sau đ ghi ch p các triệu chứng lâm sàng của gà nghi mắc ORT c n sống: ủ rũ, gà ngáp kh thở, đôi khi hắt hơi, vảy mỏ, mũi c dịch viêm, đau mắt,...
3.4 Phƣơng pháp ổ há
Với những gia cầm c triệu chứng r ràng, chúng tôi tiến hành mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan theo quy trình mổ khám gia cầm của Cục Thú y. Gà đƣợc cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, mổ khám theo trình tự từ trên xuống dƣới, bộc lộ các cơ quan để quan sát, tìm ra những biến đổi bệnh tích đại thể; lƣu lại hình ảnh bệnh tích đặc trƣng làm cơ sở cho việc báo cáo.
- Nếu gia cầm c n sống phải d ng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích d ng điện, cắt tiết, .
- iểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các l tự nhiên, khớp, ngoại k sinh tr ng và các tổn thƣơng,
- ổ khám kiểm tra nội tạng bên trong.
- Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh ph m. - Xử l tiêu độc xác gia cầm.
3.4 Phƣơng pháp y u và bảo quản u à tiêu bản
ẫu cơ quan tổ chức cần: lấy đúng cơ quan, đúng v ng tổn thƣơng điển hình, lấy đủ đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và đủ lƣợng cần thiết .
ẫu c thể là dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà mắc bệnh ở mọi lứa tuổi.
i i h ngoáy m i à h ngoáy h h ng d ng tăm bông vô tr ng ngoáy sâu vào l mũi/hầu họng của gà bệnh đã đƣợc vi trùng bề mặt bằng cồn 70o, để một thời gian cho dịch mũi thấm vào tăm bông, sau đ để tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trƣờng vận chuyển Stuart Transport edium , môi trƣờng nƣớc thịt vô tr ng hoặc dung dịch PBS, đậy nút và ghi nhãn rồi đƣa về ph ng thí nghiệm sau 2-8 giờ. Nếu ở xa ph ng thí nghiệm thì môi trƣờng vận chuyển phải để ở tủ lạnh. Sau vận chuyển bệnh ph m phải đƣợc cấy vào môi trƣờng phân lập thích hợp.
i i h h q n h y h ph q n: d ng k o vô tr ng cắt dọc khí quản hay phế quản, sau đ d ng tăm bông vô tr ng đƣa dọc theo đƣờng ống để lấy dịch. Đặt tăm bông vào trong môi trƣờng nhƣ trên, đậy nút ghi nhãn và vận chuyển đến ph ng thí nghiệm.
i i m à t h ph i: sau khi mổ khám gà, d ng k o vô tr ng cắt lấy tổ chức phổi ở v ng định x t nghiệm.
i i m à t h nh há ruột, hạch phổi, làm tƣơng tự nhƣ lấy mẫu tổ chức phổi.
3.4.4. Phƣơng pháp nu i c y và ph n ập vi hu n
Phân lập vi khu n là việc tách riêng vi khu n từ quần thể ban đầu nhằm mục đích đƣa vi khu n về dạng thuần khiết. Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đƣợc tạo ra từ một tế bào ban đầu. Đây là một khâu c nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật. Bằng các phƣơng pháp phân lập đƣợc vi khu n thuần khiết để từ đ xác định một số đặc điểm sinh vật, h a học gây bệnh của vi khu n.
1: Cấy mẫu bệnh ph m nghi chứa vi khu n lên trên môi trƣờng thạch máu Columbia đã chu n bị từ trƣớc bổ sung 5-10% máu thỏ hoặc máu cừu và 10 g/ml Gentamicine).
2: đĩa môi trƣờng trong tủ ấm 37o
C, CO2 5% trong thời gian từ 24-72 giờ.
3: ựa chọn những khu n lạc nghi cấy chuyển sang môi trƣờng tƣơng tự.
4: đĩa môi trƣờng trong tủ ấm 37oC, CO2 5% trong thời gian từ 24-72 giờ.
5: ựa chọn những khu n lạc trên môi trƣờng thử phản ứng Catalase, Oxidase,
6: Cấy chuyển những khu n lạc trên sang môi trƣờng BHB môi trƣờng dinh dƣỡng máu tim .
7: đĩa môi trƣờng trong tủ ấm 37oC, CO2 5% trong thời gian từ 24-72 giờ.
8: Thử phản ứng Indol.
c 9: Giữ giống trong môi trƣờng có bổ sung 15 – 20% Glycerol, bảo quản trong tủ lạnh -860C.
Phƣơng pháp nhuộm Gram
Dựa trên cơ sở sự khác biệt về cấu trúc của vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi khu n Gram dƣơng s giữ đƣợc phức hợp tím gentians không bị t y màu bởi cồn-axeton, trong khi vi khu n Gram âm không giữ đƣợc phức hợp này. Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khu n Gram dƣơng vẫn giữ đƣợc màu tím Gentian còn vi khu n Gram âm bắt màu hồng của Fucshin.
Các bƣớc tiến hành:
Bƣớc 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản. Nhỏ lên lam kính sạch 1 giọt nƣớc muối sinh lý, dùng que cấy vô trùng lấy 1-3 khu n lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nƣớc để khô trong điều kiện tự nhiên. Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để vi khu n gắn chặt vào phiến kính và để vi khu n bắt màu đƣợc tốt hơn.
Bƣớc 2: nhuộm màu
- Nhỏ dung dịch tím Gentian để yên trong vòng 1 phút, rửa nƣớc. - Nhỏ dung dịch ugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nƣớc.
- Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, rửa nƣớc. - Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nƣớc, để khô. Quan sát hình thái vi khu n đƣợc nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100x.
3.4.6 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu huyết học
phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y , Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.4.7 Phƣơng pháp PCR
3.4.7.1.Phương pháp chi t tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN QI GEN Inc., US để tách chiết DNA tổng số theo các bƣớc:
ước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
ước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. ở 70oC trong 30 phút.
ước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
ước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dƣới.
ước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới.
ước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dƣới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa nhƣ trên.
ước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khu n trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 l Buffer E, để ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút. Sau đ ly tâm 13000 v ng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dƣới, bảo quản ở -20oC.
3.4.7.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành ph n của phản ứng PCR: STT Nội dung Th tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
i i đoạn ƣ c Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
1 Du i mạch 94 5 phút 1
2
Du i mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3
Hoàn chỉnh 72 7 phút
1
Dừng phản ứng 4
3 4 7 3 Điện di kiểm tra sản ph m PCR
ước 1: Chu n bị thạch garose 1.2%: Cân 1.2g garose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong l vi s ng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 l Syber green, đổ thạch c số giếng tƣơng ứng số mẫu cần điện di.
ước 2: Chu n bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8l sản ph m RT-PCR
ước 3: Chu n bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
ước 4: Nhỏ marker và sản ph m PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6l maker 100bp và 10l sản ph m PCR m i giếng.
ước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
ước 6: Quan sát kết quả điện di sản ph m PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.4.8 Phương pháp iệ
Sử dụng phƣơng pháp thống kê sinh học, Excel, kiểm tra sự sai khác bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai một yếu tố (p<0,05)
3.5. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU
3.5 M u bệnh ph
Gà và các mẫu bệnh ph m mắc hoặc nghi mắc ORT thu thập đƣợc nhƣ: phổi, hạch phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab dịch nƣớc mũi, mắt, miệng, ổ nhớp , lách, ruột, hạch,
3.5 Máy c
Tủ ấm 37oC, tủ -86oC, kính hiển vi, máy ly tâm, máy votex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, các máy hấp, sấy dụng cụ, máy phân tích các chỉ tiêu huyết học Celldyn – 3700,
3.5 ụng cụ
Dao, k o, pank, k p, khay, eppendorf, lamen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, cốc đong h a chất, đèn cồn, ống đựng formol 10%, ống nghiệm, dụng cụ bảo hộ lao động kh u trang, áo blouse, găng tay, .
3.5 ch t
Thuốc nhuộm Gram tím Gentian, đỏ Fucsin, dung dịch lugol, cồn axeton), ethanol, PBS, , H2O2 3%, thuốc thử ovac s, các loại kháng sinh; h a chất d ng trong chiết tách RN , thực hiện phản ứng PCR,
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA BỆNHDO ORT GÂY TRÊN
ĐÀN GÀ
4.1.1 T nh h nh gà ắc bệnh ORT theo ứ tuổi
Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành điều tra, thu thập số liệu, gà chết đều đƣợc mổ khám, kiểm tra bệnh tích và ghi chép lại từ đ đánh giá khả năng thích nghi, nhiễm bệnh để có biện pháp phòng bệnh chủ động. Qua các số liệu thống kê ở các hộ, các trại nuôi gà chúng tôi đã thu thập đƣợc số liệu từ mọi độ tuổi của gà và chia làm 3 giai đoạn: từ 1-6 tuần tuổi, từ 7-20 tuần tuổi và trên 20 tuần tuổi. Kết quả thu đƣợc tổng hợp và trình bày thông qua bảng 4.1
Bảng 4.1. Tình hình mắc bệnh do ORT theo lứa tuổi của gà tại tỉnh Bắc Giang ứ tuổi tuần tuổi Số hộ đi u tr hộ Số gà đi u tr (con) Số gà ắc (con) T ệ mắc (%) Số gà chết (con) T lệ chết (%) 0-6 27 356 184 51,69 93 26,12 7-20 24 349 156 44,70 83 23,78 20 19 326 138 42,33 59 18,10 Tổng 70 1.031 478 46,36 235 22,79
Kết quả cho thấy, số lƣợng gà mắc ORT ở các giai đoạn phát triển là khác nhau. Gà từ 1- 6 tuần tuổi, chúng tôi tiến hành điều tra 27 hộ với tổng số 356 con, trong đ c 184 con mắc, chiếm tỷ lệ 51,69%. Giai đoạn gà từ 7 - 20 tuần tuổi, tiến hành điều tra 24 hộ, có156 con trong tổng số 349 con điều tra, chiếm tỷ lệ 44,70%. Giai đoạn gà trên 20 tuần tuổi trong số 326 con đƣợc điều tra có 138 con mắc tại 19 hộ chăn nuôi, tỷ lệ mắc chiếm 42,33%.
Nhƣ vậy, trong tổng số 70 hộ đƣợc điều tra chăn nuôi hộ gia đình và chăn nuôi trang trại), tỷ lệ mắc trung bình chiếm khoảng 46,36%. Trong đ , giai đoạn từ 1-6 tuần tuổi chiếm tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là 51,69%, tiếp theo là đến nhóm gà 7-20 tuần tuổi chiếm tỷ lệ khoảng 44,70%, gà trên 20 tuần tuổi là có tỷ lệ mắc thấp nhất khoảng 42,33%.
trung bình 22,79%. Trong đ tỷ lệ chết cao nhất là nhóm gà 1 - 6 tuần tuổi, chiếm tỷ lệ 26,12% (93 con chết trong tổng số 356 con điều tra); tiếp theo là nhóm gà 7 - 20 tuần tuổi tỷ lệ chết là 23,78% (83 con chết trong tổng số 349 con điều tra); và tỷ lệ chết thấp nhất là ở nhóm gà trên 20 tuần tuổi 18,10% (59 con chết trong tổng số 326 con điều tra).
Kết quả này cũng ph hợp với nghiên cứu của Roepke, Roepke đã phát hiện các triệu chứng bệnh và tỷ lệ chết cao hơn ở các gà tây trƣởng thành và ở các gà non chủ yếu chỉ c các triệu chứng bệnh thông thƣờng. một số trƣờng hợp, gà non mắc bệnh từ 2-8 tuần tuổi, tỷ lệ chết thƣờng trong khoảng 1-15% trong pha cấp tính 8 ngày , nhƣng tỷ lệ nhiễm c thể tăng cao với tỷ lệ chết tới 50%.
Gà công nghiệp từ 20-50 tuần tuổi nhiễm với tỷ lệ tử vong tăng. Trong gà tây, nhiễm O. rhinotracheale đã đƣợc phát hiện ở gà 2 tuần tuổi, nhƣng mức độ nhiễm và tỷ lệ tử vong cao (Chin and Charlton, 2008; Chin et al., 2008), tỷ lệ tử vong khoảng 1% ~ 15%, nhƣng c thể lên đến 50%. Triệu chứng điển hình là ho, khó thở, chảy nƣớc mắt, nƣớc mũi Chin et al., 2008).
Điều này có thể đƣợc lý giải nhƣ sau: ở độ tuổi 1-6 tuần tuổi và giai đoạn 7-20 tuần tuổi gà chịu tác động của nhiều điều kiện bất lợi, hàm lƣợng kháng thể thụ động, phần lớn lƣợng kháng thể đƣợc cung cấp bởi quá trình làm vắc xin của ngƣời chăn nuôi, mà ở giai đoạn này là giai đoạn mà con gà đang ở độ tuổi đƣợc làm vắc xin nhiều nhất, khi đ cơ thể gà chƣa đáp ứng đƣợc miễn dịch một cách đầy đủ, sức đề kháng chƣa cao. Cũng ở độ tuổi này, gà rất dễ và hay mắc một số bệnh truyền nhiễm nhƣ Gumboro, E.coli, Newcastle, CRD, thƣơng hàn bạch lỵ, cầu tr ng, làm cho sức đề kháng kém, dẫn đến gà có nguy cơ nhiễm ORT cao hơn.
Từ 20 tuần tuổi trở lên, gà đã thành thục, miễn dịch đã đƣợc đáp ứng một cách đầy đủ, sức đề kháng tốt, nguy cơ nhiễm bệnh cũng giảm.
Kết quả nghiên cứu đƣợc thể hiện rõ ràng thông qua hình 4.1.
Nhìn hình ta thấy cột biểu thị tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết của gà ở lứa tuổi 1 - 6 tuần tuổi cao nhất tƣơng ứng với 51,69% và 26,12%; tiếp đến 44,70% tỷ lệ mắc, 23,78% tỷ lệ chết gà ở lứa tuổi 7 - 20 tuần tuổi và cột biểu thị thấp nhất trong hình ứng với gà ở lứa tuổi trên 20 tuần (42,33% và 18,10%).
51,69 26,12 44,70 23,78 42,33 18,10 0 10 20 30 40 50 60
1 - 6 tuần tuổi 7 - 20 tuần tuổi 20 tuần tuổi ứ tuổi
T ệ %
Tỷ lệ mắc ORT Tỷ lệ chết
Hình 4.1. Tình hình mắc bệnh do ORT theo lứa tuổi của gà tại tỉnh Bắc Giang
4.1.2 T nh h nh gà ắc bệnh do ORT theo vụ
Quá trình theo dõi tình hình mắc bệnh do ORT trên đàn gà nuôi tại tỉnh Bắc Giang đƣợc thể hiện thông qua bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tình hình gà mắc bệnh do ORT theo mùa vụ tại tỉnh Bắc Giang
Mùa vụ Tuổi (tuần) Số con theo dõi Số con mắc T lệ mắc (%) Số con chết T lệ chết (%) Đông Xuân 0-6 180 97 53,89 57 31,67 7-20 172 84 48,84 42 24,42 20 166 73 43,98 29 17,47 Hè Thu 0-6 176 86 48,86 46 26,14 7-20 177 76 42,94 35 19,77 20 160 62 38,75 26 16,25 Tổng 1.031 478 46,36 235 22,79
Kết quả bảng 4.2 cho thấy: tỷ lệ mắc bệnh do ORT trên đàn gà nuôi tại địa bàn tỉnh trong vụ Đông Xuân cao hơn vụ Hè Thu. Cụ thể nhƣ sau:
Giai đoạn gà 1 - 6 tuần tuổi: vụ Đông Xuân c tỷ lệ mắc bệnh chiếm 53,89% (có 97 con mắc trên tổng số 180 con theo d i ; trong khi đ vụ Hè Thu tỷ lệ mắc bệnh chiếm 48,86% (86 con mắc trên tổng số 176 con theo dõi).
Giai đoạn gà từ 7 - 20 tuần tuổi: vụ Đông Xuân c tỷ lệ mắc bệnh chiếm 48,84% (có 84 con mắc trên tổng số 172 con theo d i ; trong khi đ vụ Hè Thu tỷ lệ mắc bệnh chiếm 42,94% (76 con mắc trên tổng số 177 con theo dõi).
Giai đoạn gà trên 20 tuần tuổi: vụ Đông Xuân c tỷ lệ mắc bệnh chiếm