4.1.7. Kết quả nuôi c y và phân lập vi khu n trên đàn gà bi u hiện triệu chứng lâm sàng mắc ORT
Sau khi giám định chính xác gà mắc bệnh do ORT bằng kỹ thuật PCR, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu bệnh ph m nuôi cấy trên môi trƣờng thạch máu Colombia Blood Agar (có bổ sung 5% máu thỏ và 10µg/ml Gentamicin), ở điều kiện 37oC, CO2 5% ủ trong thời gian 24-72 giờ để kiểm tra sự có mặt của vi khu n c trong cơ thể. Kết quả nuôi cấy đƣợc thể hiện thông qua hình 4.13.
Hình 4.11. Kết quả nuôi cấy vi khuẩn ORT t n ô t ƣờng thạch máu
Kết quả hình 4.11 cho thấy: trên môi trƣờng CBA (Columbia Blood Agar), khu n lạc phát triển thành những đám c kích thƣớc khác nhau, khu n lạc nhỏ, to bằng đầu đinh ghim, tr n, đục, c màu xám đến xám trắng hoặc gây dung huyết yếu hoặc không gây dung huyết. Kết quả này cũng ph hợp với các nghiên cứu trƣớc đây đã đƣợc công bố (Mohammed Zahra et al.; Võ Thị Trà An và cs, 2014).
Từ kết quả trên, chúng tôi tiến hành lấy khu n lạc đặc trƣng kiểm tra một số phản ứng sinh hóa của chúng (Oxidase, Catalase), kết quả đƣợc thể hiện thông qua hình 4.12.
Hình 4.12. Kết quả kiểm tra một số đặc tính sinh hóa của vi khuẩn ORT
Thông qua hình 4.12 chúng tôi nhận thấy: với những khu n lạc của vi khu n ORT trên môi trƣờng CBA cho kết quả nhƣ phản ứng Catalase âm tính (ORT không có men Catalase nên chúng không có khả năng phân hủy H2O2 tạo thành H2O và O2 vì vậy phản ứng không tạo bọt); phản ứng Oxidase dƣơng tính (phản ứng chuyển thành màu tím than). Kết quả này cũng ph hợp với các nghiên cứu trƣớc đây của (Mohammed Zahra et al.; Võ Thị Trà An và cs, 2014).
Chúng tôi tiếp tục lựa chọn những khu n lạc điển hình trên, tăng sinh trên môi trƣờng BHB, ủ 37oC trong thời gian 24 giờ, CO2 5%. Tiến hành lấy canh khu n trên thử phản ứng Indol, kết quả thu đƣợc thể hiện thông qua hình 4.13.
Hình 4.13. Kết quả kiểm tra phản ứn Indo đối với vi khuẩn ORT
Nhƣ vậy, phản ứng Indol cũng cho kết quả âm tính (kết quả này cũng ph hợp với nghiên cứu trƣớc đây longkorn monsin et al., 1997).
Để xác định hình thái của chủng vi khu n ORT phân lập đƣợc tại tỉnh Bắc Giang; chúng tôi tiến hành nhuộm gram theo quy trình hƣớng dẫn của nhà sản xuất.
Kết quả thu đƣợc đƣợc thể hiện thông qua hình 4.14.
Hình 4.14. Hình thái vi khuẩn ORT dƣới kính hiển vi
Kết quả hình 4.16 cho thấy: vi khu n ORT phân lập đƣợc là gram âm bắt màu đỏ và rất đa dạng khi kiểm tra trên kính hiển vi. ết quả này cũng ph hợp với nghiên cứu trƣớc đây khi cho rằng: ORT phân lập đƣợc là gram âm và đa dạng khi kiểm tra trên kính hiển vi Qing Pan et al., 2012).
Theo Nguyễn Thị an và cs 2014 nguồn chứa vi khu n ORT thƣờng c trong phổi, túi khí, chất tiết của đƣờng hô hấp nhƣ: nƣớc mũi, nƣớc mắt, dịch nhầy khí quản và ở hai bên phế quản của gia cầm mắc bệnh. hi thời tiết thay đổi đột ngột, mật độ nuôi quá cao, kh u phần ăn không đảm bảo vệ sinh, dụng cụ chăn nuôi không đảm bảo, hi những điều kiện bất lợi đ tấn công làm cho sức đề kháng của đàn gà giảm sút tạo điều kiện thuận lợi cho vi khu n phát triển và gây bệnh.
ầm bệnh sau khi xâm nhập vào đƣờng hô hấp chúng s sinh trƣởng và phát triển ở niêm mạc đƣờng hô hấp và nhanh ch ng tấn công đến cơ quan đích là phổi, gây ra các bệnh tích đặc trƣng là viêm phổi, viêm màng phổi, viêm túi khí, Trên cơ sở đ , để tìm hiểu vai tr gây bệnh của vi khu n này ở trên gà, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy phân lập vi khu n ORT từ các mẫu bệnh ph m khí quản, phổi, dịch swab, túi khí và gan, lấy từ 50 con gà ở mọi lứa tuổi c triệu chứng về
hô hấp mắc bệnh do ORT thu thập tại tỉnh Bắc Giang. Gà nghi nhiễm đƣợc đƣa về ph ng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y cụm II để tiến hành phân lập vi khu n 05 mẫu bệnh ph m/ 1 con . Bằng phƣơng pháp lấy mẫu và nuôi cấy, kết quả thu đƣợc sau 24-72 giờ nuôi trong tủ ấm và đƣợc trình bày ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn ORT từ mẫu bệnh phẩm
theo nhóm gà STT Nhóm gà M u bệnh ph m Số phân lập Số m u dƣơng tính T lệ (%) 1 1-6 tuần tuổi 21 105 91 86,67 2 Gà đẻ 16 80 66 82,50 3 Gà thịt 13 65 51 78,46 Tổng 50 250 208 83,20
Ghi chú: m i con gà lấy 5 loại bệnh ph m (khí quản, phổi, dịch swab, túi khí và tim)
Thông qua bảng 4.9 cho thấy: trong tổng số 250 mẫu đƣợc lựa chọn phân lập (m i con lựa chọn ra 5 cơ quan/bộ phận: khí quản, phổi, dịch swab, túi khí và tim) có 208 mẫu cho kết quả dƣơng tính, chiếm tỷ lệ 83,20%. Trong đ : gà 1-6 tuần tuổi chiếm tỷ lệ cao nhất 86,67% (91 mẫu dƣơng tính/ 105 mẫu phân lập); tiếp theo là gà đẻ chiếm tỷ lệ 82,50% (66 mẫu dƣơng tính/ 80 mẫu phân lập) và cuối cùng là gà thịt chiếm tỷ lệ thấp nhất 78,46% (51 mẫu dƣơng tính/ 65 mẫu phân lập). Kết quả đƣợc thể hiện qua hình 4.15
86,67 82,5 78,46 72 76 80 84 88 1-6 tuần tuổi Gà đẻ Gà thịt Nhóm gà T ệ u dƣơng tính (%)
Hình 4.15. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn ORT từ mẫu bệnh phẩm theo nhóm gà
Để thấy r hơn tỷ lệ dƣơng tính với bệnh do ORT chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ dƣơng tính trên các loại bệnh ph m khác nhau. đây việc so sánh đƣợc tiến hành trên 05 mẫu bệnh ph m, đƣợc phân lập từ m i con gà có triệu chứng, bệnh tích ORT trong tổng số 50 con. Kết quả đƣợc thể hiện qua bảng 4.10.
Bảng 4.10. Kết quả phân lập vi khuẩn ORT từ mẫu bệnh phẩm
STT Loại bệnh ph m Số m u ki m tra Kết quả phân lập Số m u dƣơng tính T lệ (%) 1 Phổi 50 50 100 2 Khí quản 50 50 100 3 Dịch Swab 50 47 94 4 Túi khí 50 45 90 5 Tim 50 16 32 Tổng 250 208 83,2
Kết quả ở bảng 4.10 cho thấy tỷ lệ phân lập đƣợc vi khu n ORT cao nhất ở phổi và khí quản (100%), tiếp theo đ là ở dịch swab (94%), túi khí (90%) và thấp nhất là ở tim (32%). Tỷ lệ phân lập bình quân ở 05 cơ quan trên là 83,2%. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với cơ chế gây bệnh của vi khu n ORT, mầm bệnh xâm nhập theo đƣờng hô hấp, sinh trƣởng và phát triển ở niêm mạc đƣờng hô hấp sau đ đi đến phổi và gây ra hiện tƣợng viêm phổi, viêm màng phổi, viêm túi khí. Vì vậy, nên phổi, khí quản, túi khí, dịch swab có tỷ lệ phân lập cao hơn ở các cơ quan khác. Kết quả đƣợc thể hiện rõ qua hình 4.16
100 100 94 90 32 0 20 40 60 80 100
Phổi hí quản Dịch Swab Túi khí Tim oại bệnh ph
T ệ u dƣơng tính (%)
Theo các nghiên cứu vào năm 1981, lần đầu tiên ngƣời ta phân lập đƣợc một chủng ORT từ dịch nƣớc mũi, dịch phù ở mặt, mủ và tơ huyết trên túi khí viêm của gà tây nuôi tại phía Bắc nƣớc Đức.
Theo Du Preez thấy rằng đã phân lập đƣợc vi khu n ORT trên các đàn gà thịt thƣơng ph m tại Nam Phi có các biểu hiện về đƣờng hô hấp.
Bock et al., 1995 đã tìm thấy vi khu n trong mẫu bệnh ph m đƣờng hô hấp của gia cầm ở Israel.
Từ những kết quả nghiên cứu của các tác giả và của chúng tôi, có thể nhận xét gà mắc bệnh mang vi khu n ORT ở khí quản, túi khí, phổi, dịch swab với tỷ lệ rất cao và có mặt ở hầu hết các cơ quan nhƣng với tỷ lệ thấp hơn. ết quả nghiên cứu này còn một lần nữa khẳng định vai trò gây bệnh của vi khu n ORT trên gà tại Việt Nam. Kết quả phân lập đ c nghĩa chính xác trong ch n đoán, cho ph p xác định bệnh và nhanh chóng có biện pháp phòng và chữa trị hiệu quả bệnh do ORT, giảm thiệt hại kinh tế cho ngƣời chăn nuôi.
Từ các kết quả trên, chúng tôi đã lựa chọn ra các mẫu cho kết quả phân lập dƣơng tính, tiến hành chiết tách DNA của vi khu n ORT và tiến hành thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra có hay không DNA của vi khu n ORT trong canh khu n. Kết quả phản ứng PCR đƣợc thể hiện thông qua hình 4.17 và bảng 4.9.
Hình 4.17. Kết quả định sự có mặt của vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR
M. 100 p DNA er; 7. i ch ng ơng (ONL); 6. i ch ng âm; 1, 2, 3, 4, 5, 8 là m u c n giám đ nh
PCR nhƣ trong thiết kế (sản ph m PCR thiết kế 784bp . Đối chứng âm không lên vạch tƣơng đƣơng đối chứng dƣơng; chứng tỏ phản ứng hợp cách, cho độ tin cậy cao trong quá trình phân tích và đánh giá kết quả. Các mẫu cần kiểm tra cho sản ph m PCR nhỏ hơn 800bp khoảng 784bp . Nhƣ vậy, trong canh khu n có chứa DNA của vi khu n ORT.
Bảng 4.11. Kết quả định sự có mặt của vi khuẩn ORT
bằng kỹ thuật PCR STT Nhóm gà Số m u ki m tra Số m u dƣơng tính T lệ (%) 1 1-6 tuần tuổi 42 37 88,10 2 Gà đẻ 28 24 85,71 3 Gà thịt 22 18 81,82 Tổng 92 79 86,81
Nhƣ vậy, trong tổng số 92 mẫu phân lập cho kết quả dƣơng tính với vi khu n ORT, có tới 79 mẫu cho kết quả với cặp mồi đặc hiệu, chiếm tỷ lệ 86,81%. Trong đ , nh m gà 1-6 tuần tuổi có 37 mẫu cho kết quả dƣơng tính trong tổng số 42 mẫu kiểm tra (chiếm tỷ lệ 88,10%); tiếp đến là gà đẻ có 24 mẫu dƣơng tính trong tổng số 28 mẫu kiểm tra (chiếm tỷ lệ 85,71%) và cuối cùng là gà thịt có 18 mẫu dƣơng tính trong tổng số 22 mẫu kiểm tra (chiếm tỷ lệ 81,82%).
Kết quả đ thể hiện rõ qua hình 4.18
88,10 85,71 81,82 76 80 84 88 92 1-6 tuần tuổi Gà đẻ Gà thịt Nhóm gà T ệ u dƣơng tính (%)
Hình 4.18. Kết quả định sự có mặt của vi khuẩn ORT
4.2. NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH LÝ MÁU TRÊN GÀ MẮC BỆNH DO ORT BỆNH DO ORT
Nhƣ ta đã biết, số lƣợng hồng cầu của một loài là tƣơng đối ổn định; tuy nhiên, n cũng c sự thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong đ c yếu tố của bệnh. Trên cơ sở đ , chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và kiểm tra các chỉ tiêu hệ hồng cầu của gà bị bệnh do ORT phân lập đƣợc.
Số lƣợng hồng cầu của một loài tƣơng đối ổn định, tuy nhiên n cũng c sự thay đổi phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong đ c yếu tố của bệnh. Các chỉ tiêu hệ hồng cầu của gà mắc ORT đƣợc trình bày ở bảng 4.12.
Bảng 4.12. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu hệ hồng cầu ở gà mắc bệnh do ORT ở gà mắc bệnh do ORT STT Chỉ tiêu Gà mắc bệnh (n=50); X ± SE Gà khỏe mạnh (n=50); X ± SE 1 Số lƣợng hồng cầu (triệu/µl) 1,84 ± 0,03 2,52 ± 0,06 2 Hàm lƣợng Hb (g/l) 70,4 ± 0,13 96,0 ± 0,18 3 Tỷ khối hồng cầu (%) 22,86 ± 0,77 30,75 ± 0,88 4 Thể tích bình quân hồng cầu (fl) 125,41 ± 4,10 123,30 ± 4,85 5 ƣợng huyết sắc tố bình quân hồng cầu (g/l) 38,49 ± 1,05 38,62 ± 1,44 6 Nồng độ huyết sắc tố bình quân hồng cầu (g/l) 313,8 ± 1,37 318,4 ± 1,33 7 Diện tích bình quân của hồng cầu (%CV) 13,0 ± 0,19 12,71 ± 0,26
Bảng 4.12 cho thấy: đối với gà mắc bệnh do ORT số lƣợng hồng cầu 1,84 triệu/µl, giảm đáng kể so với gà khỏe mạnh 2,52 triệu/µl P<0,05 . Điều này chứng tỏ, khi gà bị bệnh do ORT khả năng tiêu h a và hấp thu chất dinh dƣỡng đối với cơ thể giảm; do vậy, khả năng sinh hồng cầu giảm. Điều này phù hợp với nghiên cứu trƣớc đây cho rằng: đối với gà khỏe mạnh, số lƣợng hồng cầu giao động trong khoảng 2,5-3,2 triệu/1µl (Cù Xuân Dần và cs, 1996).
Hàm lƣợng huyết sắc tố tỷ lệ thuận với số lƣợng hồng cầu. Do vậy, khi số lƣợng hồng cầu giảm thì hàm lƣợng huyết sắc tố cũng giảm. Kết quả bảng 4.12 cho thấy hàm lƣợng huyết sắc tố của gà mắc bệnh 70,4g/l so với 96,0g/l đối với gà khỏe mạnh.
khỏe mạnh (30,75%). Nguyên nhân là do số lƣợng hồng cầu giảm xuống dẫn đến thể tích hồng cầu so với thể tích máu toàn phần giảm.
Gà khỏe có thể tích bình quân hồng cầu là 123,30fl, khi gà bị bệnh do ORT thể tích bình quân hồng cầu là 125,41fl. Kết quả trên cho thấy khi gà mắc bệnh do ORT, thể tích bình quân của hồng cầu tăng lên nhằm mục đích tăng tiết diện tiếp xúc với oxy để b cho lƣợng hồng cầu giảm nhất định, đây cũng là phản ứng thích nghi của cơ thể đối với bệnh. Theo Hồ Văn Năm 1982 thể tích bình quân của hồng cầu ở gà khỏe mạnh là 127fl. Kết quả nghiên cứu ở gà khỏe của chúng tôi cũng tƣơng đƣơng nhƣ vậy.
Hàm lƣợng huyết sắc tố bình quân hồng cầu đối với gà mắc ORT so với gà khỏe mạnh thay đổi không đáng kể (38,49pg so với 38,62pg). Nồng độ huyết sắc tố bình quân giữa hồng cầu giữa gà mắc bệnh do ORT và gà khỏe mạnh cũng chênh lệch nhau không đáng kể (313,8 g/l so với 318,4 g/l) và diện tích bình quân của hồng cầu giữa gà mắc bệnh do ORT so với gà khỏe mạnh chênh lệch nhau không nhiều (13,0 so với 12,71).
Cùng với việc phân tích chỉ tiêu hệ hồng cầu của gà mắc ORT so với gà khỏe mạnh, chúng tôi cũng tiến hành phân tích chỉ tiêu hệ bạch cầu. Kết quả thu đƣợc thể hiện thông qua bảng 4.13.
Bảng 4.13. Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu hệ bạch cầu ở gà mắc bệnh do ORT ở gà mắc bệnh do ORT STT Chỉ tiêu Gà mắc bệnh (n=50); X ± SE Gà khỏe mạnh (n=50); X ± SE 1 Số lƣợng bạch cầu (nghìn/µl) 30,27 ± 0,71 13,63 ± 0,46 Công thức bạch cầu
2 Bạch cầu đa nhân trung tính %N 52,84 ± 0,90 35,24± 0,39
3 Tế bào Lympho (%L) 41,01 ± 0,97 60,89 ± 0,41
4 Bạch cầu đơn nhân lớn (%M) 2,83 ± 0,16 2,62 ± 0,31
5 Bạch cầu ái kiềm (%E) 0,11 ± 0,03 0,13 ± 0,05
à ắc bệnh ORT
3,24% 0,11% 2,83%
41,01% 52,84%
Bạch cầu đa nhân trung tính Tế bào ympho Bạch cầu đơn nhân lớn Bạch cầu ái kiềm Bạch cầu ái toan
Hình 4.19. Chỉ tiêu bạch cầu gà mắc bệnh do ORT bệnh do ORT à hoẻ ạnh 0,13% 2,62% 60,89% 1,12% 35,24%
Bạch cầu đa nhân trung tính Tế bào ympho Bạch cầu đơn nhân lớn Bạch cầu ái kiềm Bạch cầu ái toan
Hình 4.20. Chỉ tiêu bạch cầu gà khoẻ
Dữ liệu bảng 4.13 và hình 4.19; hình 4.20 cho thấy: khi con vật bị mắc bệnh do ORT số lƣợng bạch cầu tăng rất cao 30,27 nghìn/µl trong khi ở gà khỏe là 13,63 nghìn/ l. Điều này có thể đƣợc lý giải: do cơ thể nhiễm khu n, số lƣợng bạch cầu tăng cao nhằm thực hiện quá trình thực bào bảo vệ cơ thể.
Đối với công thức bạch cầu: ở gà bệnh, tỷ lệ bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu ái toan tăng lên r rệt so với gà khỏe. Bạch cầu đa nhân trung tính của gà bệnh là 52,84%; trong khi đ tỷ lệ bạch cầu đa nhân trung tính của gà khỏe là 35,24%. Tỷ lệ bạch cầu ái toan của gà bệnh là 3,24%, trong khi đ tỷ lệ này của gà khỏe là 1,12%. Ngƣợc lại, sự tăng của bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu ái toan, tỷ lệ tế bào lympho bị giảm tƣơng ứng. Sự thay đổi của công