Phƣơng pháp PCR

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và các chỉ tiêu sinh lý máu ở đàn gà mắc bệnh do ORT trên địa bàn tỉnh bắc giang (Trang 37 - 38)

3.4.7.1.Phương pháp chi t tách DNA

Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN QI GEN Inc., US để tách chiết DNA tổng số theo các bƣớc:

ước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.

ước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. ở 70oC trong 30 phút.

ước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.

ước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dƣới.

ước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới.

ước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dƣới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa nhƣ trên.

ước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khu n trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 l Buffer E, để ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút. Sau đ ly tâm 13000 v ng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dƣới, bảo quản ở -20oC.

3.4.7.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành ph n của phản ứng PCR: STT Nội dung Th tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:

i i đoạn ƣ c Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng

1 Du i mạch 94 5 phút 1

2

Du i mạch 94 30 giây

45

Gắn mồi 52 60 giây

Tổng hợp sợi mới 72 90 giây

3

Hoàn chỉnh 72 7 phút

1

Dừng phản ứng 4

3 4 7 3 Điện di kiểm tra sản ph m PCR

ước 1: Chu n bị thạch garose 1.2%: Cân 1.2g garose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong l vi s ng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 l Syber green, đổ thạch c số giếng tƣơng ứng số mẫu cần điện di.

ước 2: Chu n bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8l sản ph m RT-PCR

ước 3: Chu n bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.

ước 4: Nhỏ marker và sản ph m PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6l maker 100bp và 10l sản ph m PCR m i giếng.

ước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.

ước 6: Quan sát kết quả điện di sản ph m PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.

3.4.8 Phương pháp iệ

Sử dụng phƣơng pháp thống kê sinh học, Excel, kiểm tra sự sai khác bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai một yếu tố (p<0,05)

Một phần của tài liệu (LUẬN văn THẠC sĩ) nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ và các chỉ tiêu sinh lý máu ở đàn gà mắc bệnh do ORT trên địa bàn tỉnh bắc giang (Trang 37 - 38)

Tải bản đầy đủ (PDF)

(70 trang)