3.4.7.1.Phương pháp chi t tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN QI GEN Inc., US để tách chiết DNA tổng số theo các bƣớc:
ước 1: Cho 20µl Proteinase K vào ống Eppendorf. Thêm 180 µl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56oC trong 3 giờ.
ước 2: Thêm 4µl ARNase và 200 µl Buffer AL. ở 70oC trong 30 phút.
ước 3: Thêm 200 µl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
ước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Loại bỏ dịch ở dƣới.
ước 5: Thêm 500µl Buffer AW1, rồi ly tâm 8000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch dƣới.
ước 6: Thêm 500µl Buffer AW2, ly tâm 13000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ dịch dƣới. Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa nhƣ trên.
ước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khu n trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml. Thêm 100 l Buffer E, để ở nhiệt độ ph ng trong 5 phút. Sau đ ly tâm 13000 v ng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dƣới, bảo quản ở -20oC.
3.4.7.2. Quy trình thực hiện phản ứng PCR Thành ph n của phản ứng PCR: STT Nội dung Th tích (µl) 1 Nuclease-Free Water 6,5 2 Master Mix 12,5 3 Reverse Primer 0,5 4 Forward Primer 0,5 5 DNA 5 Tổng 25
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
i i đoạn ƣ c Nhiệt độ (ºC) Thời gian Số vòng
1 Du i mạch 94 5 phút 1
2
Du i mạch 94 30 giây
45
Gắn mồi 52 60 giây
Tổng hợp sợi mới 72 90 giây
3
Hoàn chỉnh 72 7 phút
1
Dừng phản ứng 4
3 4 7 3 Điện di kiểm tra sản ph m PCR
ước 1: Chu n bị thạch garose 1.2%: Cân 1.2g garose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong l vi s ng, để nguội đến khoảng 40oC bổ sung thêm 10 l Syber green, đổ thạch c số giếng tƣơng ứng số mẫu cần điện di.
ước 2: Chu n bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8l sản ph m RT-PCR
ước 3: Chu n bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
ước 4: Nhỏ marker và sản ph m PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6l maker 100bp và 10l sản ph m PCR m i giếng.
ước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
ước 6: Quan sát kết quả điện di sản ph m PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.4.8 Phương pháp iệ
Sử dụng phƣơng pháp thống kê sinh học, Excel, kiểm tra sự sai khác bằng phƣơng pháp phân tích phƣơng sai một yếu tố (p<0,05)