Phần 3 Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.4. Phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà đẻ
Chúng tôi thực hiện điều tra thu thập thông tin ngẫu nhiên các hộ chăn nuôi gà đẻ tại một số trang trại trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận cụ thể là Hà Nội, Hưng Yên và Hòa Bình theo phiếu điều tra sử dụng kháng sinh tại hộ chăn nuôi.
Các thông tin trong phiếu điều tra bao gồm: thông tin hộ chăn nuôi, quy mô đàn, tên thuốc kháng sinh sử dụng, liều dùng, thời gian dùng, mục đích sử dụng kháng sinh, cơ sở sử dụng kháng sinh...
3.4.2. Phương pháp thu thập trứng
* Thu thập mẫu:
- Các mẫu được lấy theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm tại trang trại gà đẻ với số lượng 3 quả/ mẫu, dùng găng tay một lần thu thập mẫu trứng sau đó cho vào túi zip vô trùng, đánh dấu số mẫu rồi cho vào hộp chuyên dụng có chứa vụn xốp tránh bị vỡ trứng và được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24h.
* Số lượng mẫu:
- Mỗi mẫu trứng lấy với số lượng là 3 quả.
- Lấy 4 mẫu/ hộ chăn nuôi gia cầm để xét nghiệm vi khuẩn E. coli.
3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu vận chuyển về phòng thí nghiệm được xử lý ngay, trường hợp chưa xử lý được thì mẫu được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4oC không quá 36 giờ.
Sử dụng tăm bông đã được vô trùng có tẩm nước muối sinh lý 0,9% lau vòng quanh vỏ của quả trứng. Mẫu tăm bông này được sử dụng cho phân lập vi khuẩn E. coli. Mẫu tăm bông cũng có thể bảo quản ở nhiệt độ -80oC tới khi được sử dụng.
3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu
Vi khuẩn E. coli thuần khiết được bảo quản trong dung dịch Glycerol với tỷ lệ 1:1 và được cất giữ trong tủ lạnh âm sâu -80oC.
3.4.5 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E. coli
- Vi khuẩn E. coli được phân lập trên môi trường thạch TBX. Mẫu lau tăm bông được cấy láng trên môi trường thạch TBX và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ. Các khuẩn lạc màu xanh lá cây, đứng riêng lẻ
được chọn. Các khuẩn lạc này sau đó được ria cấy lại trên môi trường thạch MacConkey để tiến hành thuần vi khuẩn. Kiểm tra tính thuần khiết bằng phương pháp nhuộm Gram.
- Vi khuẩn E. coli thuần khiết được tăng sinh trong 10 ml môi trường nước thịt pepton ở điều kiện nhiệt độ 37oC trong 18 giờ. Ống môi trường tăng sinh vi khuẩn được li tâm loại bỏ phần dung dịch peptone và thu cặn vi khuẩn. Hoàn nguyên cặn vi khuẩn thu được với 500 µl dung dịch peptone và 500 µl Glycerol. Bảo quản ở -80oC. Các bước phân lập và bảo quản giống vi khuẩn phân lập được tóm tắt ở hình dưới đây.
Hình 3.1. Tóm tắt các bước phân lập và bảo quản giống 3.4.6. Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập được. 3.4.6. Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập được.
Thử kháng sinh đồ
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm.
* Phương pháp được tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Mueller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy màu McFarland 0,5. Dùng tăm bông vô trùng tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dùng kẹp đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt thạch. + Bước 4: đặt đĩa thạch trong tủ ấm ở 37oC/18 – 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
+ Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn rồi so với bảng đường kính vòng vô khuẩn chuẩn để xác định tính mẫn cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng.
Bảng 3.1. Bảng đánh giá khả năng mẫn cảm / kháng kháng sinh của E. coli
theo (CLSI 2014) Loại kháng sinh Hàm lượng kháng sinh
Đường kính vòng vô khuẩn
Mẫn cảm ( S ) Mẫn cảm trung bình ( I ) Kháng ( R ) Tetracyclin ≥19 15-18 ≤14 Trimethoprim/Sulfamethoxazole ≥16 11-15 ≤10 Ciprofloxacin ≥24 22-23 ≤21 Gentamicin ≥15 13-14 ≤12 Nitrofurantoin ≥11 - ≤10 Colistin ≥11 9-10 ≤8 Amoxicilin/Clavunanic acid ≥18 14-17 ≤16
Sơ đồ bố trí cho phương pháp kháng sinh đồ được trình bày tại hình 3.2. Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn tăng sinh trong nước thịt được cấy láng đều trên bề mặt đĩa thạch MH. Sử dụng kẹp nhọn vô trùng đề đặt lần lượt từng khoanh giấy
tẩm kháng sinh theo thứ tự vị trí đã dánh dấu (Hình 3.2). Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng từ 15-30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán lên bề mặt đĩa thạch. Lật ngược lại đĩa thạch và đem nuôi ở tủ ấm 37oC trong 18-24 giờ. Cần lưu ý rằng, đặt phần có chữ (ký hiệu tên loại kháng sinh) áp xuống bề mặt thạch. Tuyệt đối không nhấc lên đặt lại sẽ làm sai lệch kết quả.
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí các khoanh giấy kháng sinh
Kết quả được xác định sau 24h giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC. Kích thước vòng vô khuẩn được đo chính xác bằng thước từ mặt sau của đĩa thạch. Kích thước vòng vô khuẩn sau đó được so sánh với kích thước đường kính vòng vô khuẩn của từng chủng với vòng ức chế vô khuẩn chuẩn, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm. Kết quả được đánh giá theo thang gồm nhạy cảm, trung gian, và kháng kháng sinh. Kích thước đường kính vòng vô khuẩn đối với từng loại kháng sinh được trình bày ở bảng 3.1.
Xác định gen kháng kháng sinh của chủng E.coli phân lập được
Chủng vi khuẩn E. coli đa kháng kháng sinh được gửi tới công ty BGI (Hồng Kông) để tiến hành giải trình tự genome bằng hệ thống Illumnia HiSeq 2000. Quy trình, các bước thực hiện được thực hiện bởi BGI. Khi có trình tự gen, sử dụng công cụ SPAdes 3.9 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/SPAdes/) để lắp ráp các đoạn trình tự nucleoitde (contig) thu được. Phân tích trình tự nucleotide thu
được bằng công cụ ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/) để tìm các gen kháng kháng sinh trong genome của chủng vi khuẩn. Về phân tích biến đổi của gen, các biến thể gen mobilized colistin resistance (MCR) tham chiếu được tham khảo từ nghiên cứu trước đây (Wei et al., 2018), bảng 3.2
Bảng 3.2. Trình tự gen tham chiếu mcr-1
Mã số
GenBank Mã số Protein Loài vi khuẩn Biến thể gen MCR
KX276657 anh55937 Escherichia coli MCR1
NG_051170 wp065274078 Klebsiella pneumoniae MCR1.2(Q3L) LC191581 bav82474 Escherichia coli MCR1
KY075656 aqz20430 Escherichia coli MCR1
NG_054678 wp085562392 Escherichia coli MCR1.7(A215T) KY271416 apm84489 Escherichia coli MCR1.5(H452Y) NG_052664 wp076611062 Escherichia coli MCR1.4(D440N) KX859085 aqs99092 Escherichia coli MCR1.13(M2V) NG_054697 wp085562407 Escherichia coli MCR1.8(Q3R) NG_052893 wp077248208 Salmonella enterica MCR1.6(R536H)
KX443408 ara74236 Klebsiella pneumoniae MCR1.9(V413A) NG_052861 wp077064885 Escherichia coli MCR1.3(I38V) NG_055583 wp096807442 Moraxella MCR1.10
MF176240 ask49942 Moraxella MCR2.2 NG_051171 wp065419574 Escherichia coli MCR2 NG_055496 wp078254299 Moraxella pluranimalium MCR2.1
CP014234 ame01623 Moraxella osloensis MCR-M