3.3.1. Mẫu
- Mẫu trứng gà thu thập tại các trang trại chăn nuôi
3.3.2. Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn
- Các môi trường dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn E.coli gồm: Môi trường thạch MacConkey, thạch Mueller Hinton, Tryptone Bile Glucuronic Agar (TBX), nước thịt pepton.
3.3.3. Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài
Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin và Amoxicillin-clavulanic acid.
3.3.4. Dụng cụ thí nghiệm
- Khoanh giấy tẩm kháng sinh được bảo quản theo tiêu chuẩn. Kết quả được đánh giá theo qui định của nhà sản xuất.
- Các dụng cụ trong phòng thí nghiệm dùng trong nghiên cứu vi khuẩn: Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp, buồng cấy, cân điện tử, đĩa lồng, pipet, ống nghiệm, đèn cồn, bếp điện, bình tam giác các loại, ống đong, giấy đo pH…
nước muối sinh lý 0,85%, ống so màu độ đục chuẩn (Mc Farland 0,5)…
3.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1. Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà đẻ
Chúng tôi thực hiện điều tra thu thập thông tin ngẫu nhiên các hộ chăn nuôi gà đẻ tại một số trang trại trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận cụ thể là Hà Nội, Hưng Yên và Hòa Bình theo phiếu điều tra sử dụng kháng sinh tại hộ chăn nuôi.
Các thông tin trong phiếu điều tra bao gồm: thông tin hộ chăn nuôi, quy mô đàn, tên thuốc kháng sinh sử dụng, liều dùng, thời gian dùng, mục đích sử dụng kháng sinh, cơ sở sử dụng kháng sinh...
3.4.2. Phương pháp thu thập trứng
* Thu thập mẫu:
- Các mẫu được lấy theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm tại trang trại gà đẻ với số lượng 3 quả/ mẫu, dùng găng tay một lần thu thập mẫu trứng sau đó cho vào túi zip vô trùng, đánh dấu số mẫu rồi cho vào hộp chuyên dụng có chứa vụn xốp tránh bị vỡ trứng và được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24h.
* Số lượng mẫu:
- Mỗi mẫu trứng lấy với số lượng là 3 quả.
- Lấy 4 mẫu/ hộ chăn nuôi gia cầm để xét nghiệm vi khuẩn E. coli.
3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu vận chuyển về phòng thí nghiệm được xử lý ngay, trường hợp chưa xử lý được thì mẫu được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4oC không quá 36 giờ.
Sử dụng tăm bông đã được vô trùng có tẩm nước muối sinh lý 0,9% lau vòng quanh vỏ của quả trứng. Mẫu tăm bông này được sử dụng cho phân lập vi khuẩn E. coli. Mẫu tăm bông cũng có thể bảo quản ở nhiệt độ -80oC tới khi được sử dụng.
3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu
Vi khuẩn E. coli thuần khiết được bảo quản trong dung dịch Glycerol với tỷ lệ 1:1 và được cất giữ trong tủ lạnh âm sâu -80oC.
3.4.5 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E. coli
- Vi khuẩn E. coli được phân lập trên môi trường thạch TBX. Mẫu lau tăm bông được cấy láng trên môi trường thạch TBX và nuôi trong tủ ấm ở điều kiện nhiệt độ 37oC trong vòng 24 giờ. Các khuẩn lạc màu xanh lá cây, đứng riêng lẻ
được chọn. Các khuẩn lạc này sau đó được ria cấy lại trên môi trường thạch MacConkey để tiến hành thuần vi khuẩn. Kiểm tra tính thuần khiết bằng phương pháp nhuộm Gram.
- Vi khuẩn E. coli thuần khiết được tăng sinh trong 10 ml môi trường nước thịt pepton ở điều kiện nhiệt độ 37oC trong 18 giờ. Ống môi trường tăng sinh vi khuẩn được li tâm loại bỏ phần dung dịch peptone và thu cặn vi khuẩn. Hoàn nguyên cặn vi khuẩn thu được với 500 µl dung dịch peptone và 500 µl Glycerol. Bảo quản ở -80oC. Các bước phân lập và bảo quản giống vi khuẩn phân lập được tóm tắt ở hình dưới đây.
Hình 3.1. Tóm tắt các bước phân lập và bảo quản giống 3.4.6. Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập được.
Thử kháng sinh đồ
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm.
* Phương pháp được tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Mueller Hinton.
+ Bước 2: Các chủng vi khuẩn nuôi cấy trong môi trường thích hợp ở 37oC. Lấy 1 khuẩn lạc hòa vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt được độ đục 0,5 trong dãy màu McFarland 0,5. Dùng tăm bông vô trùng tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dùng kẹp đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt thạch. + Bước 4: đặt đĩa thạch trong tủ ấm ở 37oC/18 – 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra.
+ Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn rồi so với bảng đường kính vòng vô khuẩn chuẩn để xác định tính mẫn cảm hay đề kháng của vi khuẩn với kháng sinh tương ứng.
Bảng 3.1. Bảng đánh giá khả năng mẫn cảm / kháng kháng sinh của E. coli
theo (CLSI 2014) Loại kháng sinh Hàm lượng kháng sinh
Đường kính vòng vô khuẩn
Mẫn cảm ( S ) Mẫn cảm trung bình ( I ) Kháng ( R ) Tetracyclin ≥19 15-18 ≤14 Trimethoprim/Sulfamethoxazole ≥16 11-15 ≤10 Ciprofloxacin ≥24 22-23 ≤21 Gentamicin ≥15 13-14 ≤12 Nitrofurantoin ≥11 - ≤10 Colistin ≥11 9-10 ≤8 Amoxicilin/Clavunanic acid ≥18 14-17 ≤16
Sơ đồ bố trí cho phương pháp kháng sinh đồ được trình bày tại hình 3.2. Lấy 1ml dung dịch vi khuẩn tăng sinh trong nước thịt được cấy láng đều trên bề mặt đĩa thạch MH. Sử dụng kẹp nhọn vô trùng đề đặt lần lượt từng khoanh giấy
tẩm kháng sinh theo thứ tự vị trí đã dánh dấu (Hình 3.2). Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng từ 15-30 phút cho kháng sinh từ các khoanh giấy khuếch tán lên bề mặt đĩa thạch. Lật ngược lại đĩa thạch và đem nuôi ở tủ ấm 37oC trong 18-24 giờ. Cần lưu ý rằng, đặt phần có chữ (ký hiệu tên loại kháng sinh) áp xuống bề mặt thạch. Tuyệt đối không nhấc lên đặt lại sẽ làm sai lệch kết quả.
Hình 3.2. Sơ đồ bố trí các khoanh giấy kháng sinh
Kết quả được xác định sau 24h giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC. Kích thước vòng vô khuẩn được đo chính xác bằng thước từ mặt sau của đĩa thạch. Kích thước vòng vô khuẩn sau đó được so sánh với kích thước đường kính vòng vô khuẩn của từng chủng với vòng ức chế vô khuẩn chuẩn, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm. Kết quả được đánh giá theo thang gồm nhạy cảm, trung gian, và kháng kháng sinh. Kích thước đường kính vòng vô khuẩn đối với từng loại kháng sinh được trình bày ở bảng 3.1.
Xác định gen kháng kháng sinh của chủng E.coli phân lập được
Chủng vi khuẩn E. coli đa kháng kháng sinh được gửi tới công ty BGI (Hồng Kông) để tiến hành giải trình tự genome bằng hệ thống Illumnia HiSeq 2000. Quy trình, các bước thực hiện được thực hiện bởi BGI. Khi có trình tự gen, sử dụng công cụ SPAdes 3.9 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/SPAdes/) để lắp ráp các đoạn trình tự nucleoitde (contig) thu được. Phân tích trình tự nucleotide thu
được bằng công cụ ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/) để tìm các gen kháng kháng sinh trong genome của chủng vi khuẩn. Về phân tích biến đổi của gen, các biến thể gen mobilized colistin resistance (MCR) tham chiếu được tham khảo từ nghiên cứu trước đây (Wei et al., 2018), bảng 3.2
Bảng 3.2. Trình tự gen tham chiếu mcr-1
Mã số
GenBank Mã số Protein Loài vi khuẩn Biến thể gen MCR
KX276657 anh55937 Escherichia coli MCR1
NG_051170 wp065274078 Klebsiella pneumoniae MCR1.2(Q3L) LC191581 bav82474 Escherichia coli MCR1
KY075656 aqz20430 Escherichia coli MCR1
NG_054678 wp085562392 Escherichia coli MCR1.7(A215T) KY271416 apm84489 Escherichia coli MCR1.5(H452Y) NG_052664 wp076611062 Escherichia coli MCR1.4(D440N) KX859085 aqs99092 Escherichia coli MCR1.13(M2V) NG_054697 wp085562407 Escherichia coli MCR1.8(Q3R) NG_052893 wp077248208 Salmonella enterica MCR1.6(R536H)
KX443408 ara74236 Klebsiella pneumoniae MCR1.9(V413A) NG_052861 wp077064885 Escherichia coli MCR1.3(I38V) NG_055583 wp096807442 Moraxella MCR1.10
MF176240 ask49942 Moraxella MCR2.2 NG_051171 wp065419574 Escherichia coli MCR2 NG_055496 wp078254299 Moraxella pluranimalium MCR2.1
CP014234 ame01623 Moraxella osloensis MCR-M
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học và sử dụng phần mềm Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH
Hình 4.1. Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh
Ghi chú: 12 nhóm kháng sinh được điều tra, bao gồm: Aminoglycoside (1), Amphenicols (2), Beta-lactam (3), Cephalosporin (4), Fluoroquinolone (5), Glycopeptides (6), Lincosamides (7), Macrolide (8),
Nitrofurans (9), Pleuromutilins (10), Polypeptide (11), Spectinomycin (12), Tetracycline (13) và Trimethoprim/sulfamethoxazole (14)
Hiện nay, việc sử dụng rộng rãi kháng sinh trong chăn nuôi ở Việt Nam làm gia tăng sự hiện diện của các vi khuẩn kháng thuốc. Bên cạnh đó, việc bán thuốc kháng sinh không theo đơn hay trộn thuốc kháng sinh vào thức ăn cho gia súc, gia cầm, thủy sản mà không được giám sát về chuyên môn cho thấy thuốc kháng sinh đang được sử dụng một cách thiếu trách nhiệm tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng
thuốc kháng sinh từ đó gây ảnh hưởng không nhỏ đến an toàn thực phẩm và sức khỏe con người. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là tìm hiểu được mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh với tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được ở trứng. Do vậy, nghiên cứu này đã tiến hành điều tra 50 hộ nuôi gà đẻ trên địa bàn nghiên cứu về các loại thuốc kháng sinh đã từng sử dụng hoặc đang sử dụng trong lứa nuôi (cho tới thời điểm lấy mẫu). Kết quả được trình bày ở Hình 4.1.
Có 9 trong tổng số 14 loại kháng sinh được điều tra đã được sử dụng trong quá trình chăn nuôi gà. Các loại kháng sinh được dùng thuộc về 12 nhóm kháng sinh (hình 4.1). Trong 14 loại kháng sinh được điều tra, một số loại được thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%). Nhận xét về cách dùng thuốc, chúng tôi thấy người chăn nuôi dùng kháng sinh quá lạm dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có một phần nhỏ các hộ chăn nuôi thì cập nhật kỹ thuật của một số các công ty lớn nhưng không nhiều. Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinh được dùng để phòng và trị bệnh. Thời gian ngừng sử dụng thuốc kháng sinh cho gia cầm trước khi xuất chuồng tại các hộ chăn nuôi thường theo kinh nghiệm ( Phụ Lục 1).
Theo báo cáo của WHO (1997), 50% lượng kháng sinh được sử dụng trong nông nghiệp, phần lớn là dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi . Trong năm 2001, 26,6 triệu tấn kháng sinh dùng cho động vật của nước Anh thì có 2 triệu tấn dùng trong điều trị, lượng còn lại được dùng bổ sung vào thức ăn như chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh (Brody, 2001). Việc quản lí sử dụng thuốc kháng sinh đã được thực hiện nghiêm ngặt tại các quốc gia này. Năm 2018, Việt Nam cũng đã ngừng cho phép sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích tăng trọng.
4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI
4.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn E. Coli
Nghiên cứu này đã thu thập mẫu ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận. Hình ảnh phân lập và thuần khiết E. coli trên thạch chọn lọc Macconkey và (Tryptone Bile X-glucuronide Agar, TBX) được minh họa ở hình 4.2 và 4.3
Hình 4.2. Hình ảnh đặc trưng của vi khuẩn E. coli trên môi trường (1) MacConKey và (2) TBX
Hình 4.3. Kết quả phân lập E. coli trên thạch TBX
Ghi chú: kết quả ria cấy mẫu trên thạch TBX (A, B) với hỗn hợp các loại khuẩn lạc có màu khác nhau, trong đó có màu xanh lục; chủng E. coli thuần khiết trên thạch TBX (C, D) hình thành khuẩn lạc riêng rẽ,
Do E. coli sản sinh enzyme glucuronidase nên có khả năng phân giải x- glucuronide và hình thành khuẩn lạc có màu xanh lục (Hình 4.3C-D). Tính thuần khiết của chủng E. coli phân lập được khẳng định thêm bằng phương pháp nhuộm Gram và thấy một dạng vi khuẩn thuần nhất ở trên vi trường. Các mẫu có vi khuẩn thuần nhất, khuẩn lạc màu xanh lục trên thạch TBX được kết luận là dương tính với E. coli và được tổng hợp ở bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả phân lập E. coli từ trứng và swab ổ nhớp
Loại mẫu Số mẫu
kiểm tra* Số mẫu phân lập được E. coli Tỷ lệ dương tính (%) Swab ổ nhớp 50 42 84,0 Vỏ trứng 204 68 33,3 Lòng trứng 62 1 1,6
Ghi chú: * có 62 mẫu lòng trứng trong số 204 quả trứng được dùng phân lập E. coli. Phân lập E. coli từ 50 mẫu swab ổ nhớp lấy ở gà của trang trại thu mẫu trứng.
Bảng 4.1 cho biết: vi khuẩn E. coli có ở cả 3 loại mẫu (swab ổ nhớp, vỏ trứng và lòng trứng), với tỷ lệ dương tính giảm dần theo thứ tự từ swab ổ nhớp (84,0%), vỏ trứng (33,3%) và lòng trứng (1,6%). Có thể thấy tỷ lệ phân lập được
E. coli ở vỏ trứng thấp hơn rõ rệt so với mẫu swab ổ nhớp. Sự khác biệt này là do cơ chế chống nhiễm khuẩn của trứng (Jonchère et al., 2010; Wellman-Labadie et al., 2008), với sự hiện diện của nhiều loại protein có hoạt tính diệt khuẩn trên vỏ trứng, ví dụ như: ovocleidin-17, ovocleidin-116, ovocalyxin-21, ovocalyxin- 25, ovocalyxin-32 và ovocalyxin-36 (Hamid, 2016). Về tỷ lệ dương tính, một số nghiên cứu trong nước và quốc tế cho biết tỷ lệ nhiễm E. coli ở vỏ trứng rất biến động, từ 10,5% (Eid et al., 2015) cho đến 29,1% (Trương Hà Thái và cs., 2017). So sánh với các nghiên cứu trên, tỷ lệ phân lập được E. coli ở vỏ trứng trong nghiên cứu này là phù hợp và mục tiêu của đề là nghiên cứu trên trứng nên số liệu từ swab ổ nhớp là để so sánh với mục tiêu nghiên cứu.
Kết quả xác định tỷ lệ nhiễm E. coli kể trên cho biết vỏ trứng có thể là một nguồn lây nhiễm vi khuẩn E. coli từ trang trại tới bàn ăn. Mặt khác, do tỷ lệ nhiễm E. coli ở lòng trứng rất thấp (1,6%) nên nghiên cứu này tập trung phân lập
E. coli ở vỏ trứng và dùng cho nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh. Các phần dưới đây tổng hợp kết quả phân lập E. coli ở vỏ trứng theo địa phương và theo tình trạng sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi.
Bảng 4.2. Kết quả phân lập E. coli ở vỏ trứng theo địa phương lấy mẫu
TT Địa điểm* Số mẫu
kiểm tra Số mẫu phân lập được E. coli Tỷ lệ dương tính (%) 1 Chương Mỹ 22 10 45,5 2 Đông Anh 5 0 0,0 3 Mỹ Đức 12 12 100,0 4 Nam Từ Liêm 75 7 9,3 5 Quốc Oai 20 11 55,0 6 Thanh Trì 10 3 30,0 7 Thường Tín 5 4 80,0 8 Tiên Lữ 16 1 6,3 9 Văn Giang 27 11 40,7 10 Lương Sơn 12 9 75,0 Tổng hợp 204 68 33,3
Ghi chú: * các huyện thuộc thành phố Hà Nội gồm: Chương Mỹ, Đông Anh, Mỹ Đức, Nam Từ Liêm, Quốc Oai, Thanh Trì, Thường Tín; các huyện thuộc tỉnh Hưng Yên gồm: Tiên Lữ, Văn Giang; và huyện
Lương Sơn của tỉnh Hòa Bình
Kết quả ở bảng 4.2 cho biết hiện tượng nhiễm E. coli ở vỏ trứng gặp ở hầu hết các địa phương lấy mẫu (trừ Đông Anh). Do nghiên cứu này quan tâm nghiên cứu hiện tượng kháng kháng sinh của E. coli phân lập được từ trứng, nên không so sánh tỷ lệ nhiễm giữa các địa điểm thu mẫu. Trong tổng số 29 đàn gà được lấy mẫu, có 10 đàn không sử dụng kháng sinh và 19 đàn gà dùng kháng sinh. Tỷ lệ nhiễm E. coli được tổng hợp theo tình trạng sử dụng kháng sinh (hình 4.4).
Có 29/72 (40,3%) mẫu vỏ trứng phân lập được E. coli ở nhóm không sử dụng kháng sinh. Ở nhóm sử dụng kháng sinh, E. coli phân lập được ở 39/139 (29,5%) mẫu vỏ trứng. Như vậy, vi khuẩn E. coli có mặt ở cả 2 nhóm: đàn gà không sử dụng hoặc có sử dụng kháng sinh trong quá trình chăn nuôi. Mặc dù có sự khác biệt về tỷ lệ phân lập, nhưng nghiên cứu này đã không thu thập thông tin để làm rõ về nguyên nhân của sự khác biệt nêu trên.
Hình 4.4. Tỷ lệ phân lập E. coli ở vỏ trứng theo tình trạng dùng kháng sinh
Ghi chú: nếu có ít nhất 1 loại kháng sinh được sử dụng trong lứa gà nuôi cho đến thời điểm lấy mẫu, đàn