Kết quả được xác định sau 24h giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37oC. Kích thước vòng vô khuẩn được đo chính xác bằng thước từ mặt sau của đĩa thạch. Kích thước vòng vô khuẩn sau đó được so sánh với kích thước đường kính vòng vô khuẩn của từng chủng với vòng ức chế vô khuẩn chuẩn, sau đó ghi lại kết quả của từng loại kháng sinh được thử nghiệm. Kết quả được đánh giá theo thang gồm nhạy cảm, trung gian, và kháng kháng sinh. Kích thước đường kính vòng vô khuẩn đối với từng loại kháng sinh được trình bày ở bảng 3.1.
Xác định gen kháng kháng sinh của chủng E.coli phân lập được
Chủng vi khuẩn E. coli đa kháng kháng sinh được gửi tới công ty BGI (Hồng Kông) để tiến hành giải trình tự genome bằng hệ thống Illumnia HiSeq 2000. Quy trình, các bước thực hiện được thực hiện bởi BGI. Khi có trình tự gen, sử dụng công cụ SPAdes 3.9 (https://cge.cbs.dtu.dk/services/SPAdes/) để lắp ráp các đoạn trình tự nucleoitde (contig) thu được. Phân tích trình tự nucleotide thu
được bằng công cụ ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/) để tìm các gen kháng kháng sinh trong genome của chủng vi khuẩn. Về phân tích biến đổi của gen, các biến thể gen mobilized colistin resistance (MCR) tham chiếu được tham khảo từ nghiên cứu trước đây (Wei et al., 2018), bảng 3.2
Bảng 3.2. Trình tự gen tham chiếu mcr-1
Mã số
GenBank Mã số Protein Loài vi khuẩn Biến thể gen MCR
KX276657 anh55937 Escherichia coli MCR1
NG_051170 wp065274078 Klebsiella pneumoniae MCR1.2(Q3L) LC191581 bav82474 Escherichia coli MCR1
KY075656 aqz20430 Escherichia coli MCR1
NG_054678 wp085562392 Escherichia coli MCR1.7(A215T) KY271416 apm84489 Escherichia coli MCR1.5(H452Y) NG_052664 wp076611062 Escherichia coli MCR1.4(D440N) KX859085 aqs99092 Escherichia coli MCR1.13(M2V) NG_054697 wp085562407 Escherichia coli MCR1.8(Q3R) NG_052893 wp077248208 Salmonella enterica MCR1.6(R536H)
KX443408 ara74236 Klebsiella pneumoniae MCR1.9(V413A) NG_052861 wp077064885 Escherichia coli MCR1.3(I38V) NG_055583 wp096807442 Moraxella MCR1.10
MF176240 ask49942 Moraxella MCR2.2 NG_051171 wp065419574 Escherichia coli MCR2 NG_055496 wp078254299 Moraxella pluranimalium MCR2.1
CP014234 ame01623 Moraxella osloensis MCR-M
3.5. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học và sử dụng phần mềm Excel.
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH 4.1. KẾT QUẢ ĐIỀU TRA TÌNH HÌNH SỬ DỤNG KHÁNG SINH
Hình 4.1. Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh
Ghi chú: 12 nhóm kháng sinh được điều tra, bao gồm: Aminoglycoside (1), Amphenicols (2), Beta-lactam (3), Cephalosporin (4), Fluoroquinolone (5), Glycopeptides (6), Lincosamides (7), Macrolide (8),
Nitrofurans (9), Pleuromutilins (10), Polypeptide (11), Spectinomycin (12), Tetracycline (13) và Trimethoprim/sulfamethoxazole (14)
Hiện nay, việc sử dụng rộng rãi kháng sinh trong chăn nuôi ở Việt Nam làm gia tăng sự hiện diện của các vi khuẩn kháng thuốc. Bên cạnh đó, việc bán thuốc kháng sinh không theo đơn hay trộn thuốc kháng sinh vào thức ăn cho gia súc, gia cầm, thủy sản mà không được giám sát về chuyên môn cho thấy thuốc kháng sinh đang được sử dụng một cách thiếu trách nhiệm tạo điều kiện cho vi khuẩn kháng
thuốc kháng sinh từ đó gây ảnh hưởng không nhỏ đến an toàn thực phẩm và sức khỏe con người. Vì vậy, mục tiêu của nghiên cứu này là tìm hiểu được mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh với tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được ở trứng. Do vậy, nghiên cứu này đã tiến hành điều tra 50 hộ nuôi gà đẻ trên địa bàn nghiên cứu về các loại thuốc kháng sinh đã từng sử dụng hoặc đang sử dụng trong lứa nuôi (cho tới thời điểm lấy mẫu). Kết quả được trình bày ở Hình 4.1.
Có 9 trong tổng số 14 loại kháng sinh được điều tra đã được sử dụng trong quá trình chăn nuôi gà. Các loại kháng sinh được dùng thuộc về 12 nhóm kháng sinh (hình 4.1). Trong 14 loại kháng sinh được điều tra, một số loại được thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%). Nhận xét về cách dùng thuốc, chúng tôi thấy người chăn nuôi dùng kháng sinh quá lạm dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có một phần nhỏ các hộ chăn nuôi thì cập nhật kỹ thuật của một số các công ty lớn nhưng không nhiều. Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinh được dùng để phòng và trị bệnh. Thời gian ngừng sử dụng thuốc kháng sinh cho gia cầm trước khi xuất chuồng tại các hộ chăn nuôi thường theo kinh nghiệm ( Phụ Lục 1).
Theo báo cáo của WHO (1997), 50% lượng kháng sinh được sử dụng trong nông nghiệp, phần lớn là dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi . Trong năm 2001, 26,6 triệu tấn kháng sinh dùng cho động vật của nước Anh thì có 2 triệu tấn dùng trong điều trị, lượng còn lại được dùng bổ sung vào thức ăn như chất kích thích tăng trưởng và phòng bệnh (Brody, 2001). Việc quản lí sử dụng thuốc kháng sinh đã được thực hiện nghiêm ngặt tại các quốc gia này. Năm 2018, Việt Nam cũng đã ngừng cho phép sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích tăng trọng.
4.2. KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH VI KHUẨN E. COLI
4.2.1. Kết quả phân lập vi khuẩn E. Coli
Nghiên cứu này đã thu thập mẫu ở đàn gà nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận. Hình ảnh phân lập và thuần khiết E. coli trên thạch chọn lọc Macconkey và (Tryptone Bile X-glucuronide Agar, TBX) được minh họa ở hình 4.2 và 4.3
Hình 4.2. Hình ảnh đặc trưng của vi khuẩn E. coli trên môi trường (1) MacConKey và (2) TBX