Các kết quả trình bày ở mục 4.3 đã làm rõ đặc điểm về kiểu hình kháng kháng sinh của E. coli phân lập từ trứng. Do tính trạng kháng kháng sinh do gen quy định, nên nghiên cứu này tiếp tục tìm hiểu về đặc điểm gen của E. coli đa kháng kháng sinh. Hiện có hai hướng tiếp cận chính khi nghiên cứu về gen kháng kháng sinh của E. coli, là: (1) dùng mồi đặc hiệu phát hiện các gen kháng kháng sinh (Nguyen et al., 2016; Trương Quý Dương và cs., 2017), (2) giải trình tự và phân tích trình tự genome của vi khuẩn để xác định gen mã hóa yếu tố độc lực và gen kháng kháng sinh (Rumore et al., 2018). Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chọn cách tiếp cận là giải trình tự genome của E. coli để làm rõ tất cả các gen độc lực cũng như gen kháng kháng sinh của E. coli, chúng tôi đã chọn 01 chủng E. coli đại diện (VB104) để giải trình tự genome bằng hệ thống Illumina HiSeq 2000 (Công ty BGI, Hồng Kông).
4.3.2.1. Gen kháng kháng sinh của chủng E. coli VB104
Bằng công cụ ResFinder đã xác định được 10 gen kháng kháng sinh thuộc 9 nhóm kháng sinh được mã hóa bởi genome của chủng VB104. Kết quả được tổng hợp ở bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả xác định gen kháng kháng sinh
TT Gen
kháng kháng sinh
Kháng nhóm kháng sinh
Mã số
GenBank tham chiếu
1 tet(A) Tetracycline AF534183 2 sul2 Sulphonamide AY034138 3 dfrA14 Trimethoprim KF921535 4 aph(3'')-Ib Aminoglycoside AF321551 5 aph(6)-Id Aminoglycoside CP000971 6 floR Phenicol AF118107 7 blaTEM-1B Beta-lactam AY458016 8 qnrS1 Quinolone AB187515 9 mdf(A) Macrolide Y08743 10 mcr-1.1 Polypeptide (Colistin) KP347127
Có thể thấy chủng VB104 mang gen kháng với nhiều nhóm kháng sinh. Kết quả này phù hợp với đặc điểm kiểu hình đa kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn khi thử tính mẫn cảm với giấy tẩm kháng sinh. Kết quả phát hiện gen kháng kháng sinh bằng giải trình tự genome cũng chỉ ra các loại gen kháng kháng sinh của E. coli được phát hiện bằng phương pháp PCR (Nhung và cs., 2015; Trương Quý Dương và cs., 2017). Tuy nhiên, ưu điểm của phương pháp giải trình tự genome nằm ở khả năng phát hiện nhiều gen mã hóa yếu tố độc lực khác của vi khuẩn (kết quả không trình bày) và cho phép phân tích được các biến thể (variant) của gen kháng kháng sinh. Trong nghiên cứu này, chúng tôi phân tích gen kháng kháng sinh quan trọng là: mcr-1.1 (kháng Colistin).
4.3.2.2. Đặc điểm biến đổi gen kháng nhóm MCR-1.1 của chủng VB104
Kháng sinh thuộc nhóm polypeptide (trong đó có Colistin) được xem là dòng kháng sinh cuối cùng điều trị vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem. Gen mã hóa protein kháng Colistin là mcr-1 và nằm trên plasmid, nên có khả năng truyền ngang (Wei et al., 2018). Do đó, nghiên cứu sự có mặt cũng như xác định sự xuất hiện các biến thể mới của gen mcr-1 ở các chủng vi khuẩn là cần thiết. Kết quả so sánh trình tự amino acid cho biết gen mcr-1 của chủng VB104 gồm 541 amino acid và giống hoàn toàn so với trình tự tương ứng của chủng E. coli
có mã số tham chiếu ANH55937, BAV82474 và AQZ20430 (hình 4.10).
Hình 4.10. So sánh trình tự amino acid của protein mã hóa bởi gen mcr-1
Ghi chú: Các vị trí có sự khác biệt so với chủng tham chiếu (ANH55937) mới được đánh dấu bởi mầu tương ứng với loại amino acid.
Kết quả xây dựng cây phát sinh chủng loại xác định mối liên hệ giữa gen mcr-1 của chủng VB104 với các chủng tham chiếu được trình bày ở hình 5.1
Hình 4.11. Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự amino acid của protein mã hóa bởi gen mcr-1
Đặc điểm phân nhánh của cây phát sinh chủng loại (hình 4.11) cho biết gen mcr-1 của chủng VB104 nằm trong nhóm biến thể mcr-1/2 và gần với các chủng tham chiếu là ANH55937 và AQZ20430.
Plasmid là một yếu tố di truyền di động (mobile genetic elements) tồn tại độc lập với các nhiễm sắc thể vi khuẩn và có khả năng tự tái bản. Plasmid chứa các gen kháng kháng sinh, trong đó có gen mcr-1. Bằng thực nghiệm, gen mcr-1 của E. coli đã được chứng minh có khả năng truyền ngang với tỷ lệ lên tới 54,0% (Nguyen et al., 2016). Mặt khác, các chủng E. coli mang gen kháng Colistin này lại tương đối phổ biến ở gà, ở nhiều nước trên thế giới (Maciuca et al., 2019; Quesada et al., 2016). Kết quả xác định sự có mặt của gen mcr-1 trong nghiên cứu này và nhiều nghiên cứu khác cho thấy sự cần thiết phải có sự thay đổi trong cách quản lý, sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, nhằm mục tiêu hạn chế/ ngăn chặn sự phát tán của E. coli kháng kháng sinh.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN
5.1.1. Về tình hình sử dụng kháng sinh ở các trang trại
Có 9 trong tổng số 14 loại kháng sinh được điều tra đã được sử dụng, trong đó 3 loại kháng sinh được dùng phổ biến nhất là: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%).
5.1.2. Về kết quả phân lập và giám định vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli phân lập được ở vỏ trứng của cả 2 nhóm: đàn gà không sử dụng hoặc có sử dụng kháng sinh trong quá trình chăn nuôi. Tỷ lệ phân lập là 33,3% trong tổng số 204 mẫu và phân lập được 68 chủng. Các chủng E.coli phân lập được mang đầy đủ đặc tính sinh hóa như tài liệu kinh điển đã mô tả.
5.1.3. Về đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli
- E. coli phân lập từ vỏ trứng kháng cao nhất (95,6% - 92,6% - 88,2%) với Tetracycline, Trimethoprim/Sufamethoxazole và Colistin.
- Tỷ lệ chủng E. coli kháng thuốc phân lập ở nhóm gà không sử dụng kháng sinh luôn thấp hơn ở nhóm không sử dụng kháng sinh
- Có 67/ 68 chủng phân lập kháng với ít nhất 2 nhóm kháng sinh khác nhau, chiếm tỷ lệ cao nhất (39,7%) là kháng với 4 loại kháng sinh. Kiểu hình đa kháng chủ yếu là Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole và Colistin.
- Đặc điểm di truyền của chủng vi khuẩn E. coli VB104 mang đồng thời 10 gen kháng thuốc thuộc 9 nhóm kháng sinh. Trong đó gen mcr-1 của thuộc biến thể mcr-1/2.
5.2. KIẾN NGHỊ
- Cần tiếp tục nghiên cứu về sự lưu hành của gen kháng kháng sinh để làm cơ sở cho các biện pháp ngăn ngừa sự phát tán của các chủng vi khuẩn mang gen kháng kháng sinh.
- Nghiên cứu cơ chế hình thành gen kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli
phân lập trên trứng gà.
- Nghiên cứu nguồn nguy cơ của các chủng E. coli kháng kháng sinh gây ô nhiễm ở trên trứng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Võ Thị Trà An và Đào Thị Phương Lan (2010). Đề kháng kháng sinh của Escherichia coli phân lập từ vật nuôi và sự hiện diện của β-Lactam phổ rộng. Tạp chí KHKT thú y. XVII. (2). Tr.42 – 43.
2. Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân và Nguyễn Như Pho (2002). Tình hình sử dụng kháng sinh và dư lượng kháng sinh trong thịt gà tại thành phố Hồ Chí Minh. Tạp chí KHKT thú y. XVII. (9).
3. Trương Quý Dương, Phạm Thị Ngọc, Ngô Chung Thủy, Đặng Thị Thanh Sơn, Trần Thị Nhật và Trương Thị Hương Giang, 2017. Mức độ kháng kháng sinh và gene quy định sản sinh men beta-lactamaza (ESBL) của các chủng E. coli sản sinh ESBL phân lập được từ cơ sở giết mổ lợn trên địa bàn Hà Nội. Khoa học kỹ thuật thú y 24. tr. 31-38.
4. Lê Thị Ngọc Diệp (1999). Thuốc chống vi khuẩn – phân loại – cơ chế - tác dụng – sự kháng thuốc và ứng dụng trong chăn nuôi thú y. Chuyên đề giảng dạy sau đại học, chuyên ngành Thú y, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. Tr. 2-37.
5. Đậu Ngọc Hào (2010), Kháng sinh – tác dụng phụ và độc tính. Tạp chí KHKT thú y. XVII. (1). 2010. Tr. 89 – 95.
6. Hoàng Tích Huyền (1997). Hướng dẫn sử dụng thuốc kháng sinh. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. Tr. 7-20.
7. Nguyễn Hữu Hồng và Nguyễn Thị Vinh (2007). Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn, Hướng dẫn sử dụng kháng sinh. Nhà xuất bản Y học Hà Nội. Tr.21 - 30. 8. Dương Thị Toan và Nguyễn Văn Lưu (2015). Tình hình sử dụng kháng sinh trong
chăn nuôi lợn thịt, gà thịt ở một số trại chăn nuôi trên địa bàn tỉnh Bắc Giang. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. (5). Tr.717.
9. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên và Trần Thị Lan Hương (1997). Giáo trình Vi sinh vật thú y. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Trương Hà Thái, Nguyễn Ngọc Đức (2010). Bệnh trực khuẩn coli ở một số giống gà công nghiệp hướng thịtvà khả năng kháng kháng sinh của một số chủng E. coli. Tạp chí KHKT thú y. XVI. (6). Tr. 15.
11. Trương Hà Thái, Phạm Hồng Ngân, Chu Thị Thanh Hương, Cam Thị Thu Hà, 2017. Khả năng kháng kháng sinh của E.coli và Salmonella phân lập từ trứng gia cầm bán tại một số chợ trên địa bàn thành phố Hà Nội. Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. 15. tr. 770-775.
12. Võ Thành Thìn, Lê Đình Hải, Vũ Khắc Hùng (2010). Khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn E. coli phân lập từ lợn con mắc bệnh tiêu chảy. Tạp chí KHKT thú y. XVII. (6). Tr. 5.
13. Bùi Thị Tho (2010). Dược lý học thú y. Chuyên đề giảng dạy sau đại học, chuyên ngành Thú y. Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
14. Bùi Thị Tho, 1996. Nghiên cứu tác dụng của một số thuốc hóa học trị liệu và phytoncid với E. coli phân lập từ bệnh lợn con phân trắng. Luận án phó tiến sĩ khoa học Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp 1 Hà Nội.
15. Trí, N.M., 2000. Khảo sát nồng độ ức chế tối thiểu của các kháng sinh thường dùng trên 5 loại vi khuẩn gây nhiễm trùng cộng đồng tại bệnh viện Chợ Rẫy từ 1/2000 đến 5/2000.
II. Tài liệu tiếng Anh:
16. Abellanosa I and Nichter M (1996). Antibiotic prophylaxis amongcommercial sex workers in Cebu City, Philippines. Patterns of use and perceptions of efficacy. Sex Transm Dis. 23. pp. 407 – 412.
17. Alonso, J.L., Soriano, A., Carbajo, O., Amoros, I., Garelick, H. (1999): Comparison and Recovery of Escherichia coli and Thermotolerant Coliforms in Water with a Chromogenic Medium Incubated at 41 and 44.5°C. Appl. Environ. Microbiol. 65. pp. 3746-3749.
18. Dang, S.T.T., Bortolaia, V., Tran, N.T., Le, H.Q. and Dalsgaard, A., 2018. Cephalosporin-resistant Escherichia coli isolated from farm workers and pigs in northern Vietnam. Tropical medicine & international health : TM & IH 23, 415-424. 19. Dho-Moulin, M.and Fairbrother, J. M. (1999). Avian pathogenic Escherichia coli.
Vet Res. 30. pp. 299 – 379.
20. Smith, J.L and Fratamico, P.M., (2006): Escherichia coli infections. In: Riemann, H.P., Cliver, D.O. (3rd): Food-borne infections and intoxications. Florida: Elsevier Inc. Academic Press. pp. 205-208.
21. Nguyen, N.T., Nguyen, H.M., Nguyen, C.V., Nguyen, T.V., Nguyen, M.T., Thai, H.Q., Ho, M.H., Thwaites, G., Ngo, H.T., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2016a. Use of Colistin and Other Critical Antimicrobials on Pig and Chicken Farms in Southern Vietnam and Its Association with Resistance in Commensal Escherichia coli Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 82. pp. 3727.
22. Nguyen, V.T., Carrique-Mas, J.J., Ngo, T.H., Ho, H.M., Ha, T.T., Campbell, J.I., Nguyen, T.N., Hoang, N.N., Pham, V.M., Wagenaar, J.A., Hardon, A., Thai, Q.H., Schultsz, C., 2015. Prevalence and risk factors for carriage of antimicrobial-resistant
Escherichia coli on household and small-scale chicken farms in the Mekong Delta of Vietnam. The Journal of antimicrobial chemotherapy 70. pp. 2144-2152.
23. Usui, M., Ozawa, S., Onozato, H., Kuge, R., Obata, Y., Uemae, T., Ngoc, P.T., Heriyanto, A., Chalemchaikit, T., Makita, K., Muramatsu, Y., Tamura, Y., 2014. Antimicrobial susceptibility of indicator bacteria isolated from chickens in Southeast Asian countries (Vietnam, Indonesia and Thailand). J Vet Med Sci 76. pp. 685-692. 24. Nhung, N.T., Cuong, N.V., Campbell, J., Hoa, N.T., Bryant, J.E., Truc, V.N.,
Kiet, B.T., Jombart, T., Trung, N.V., Hien, V.B., Thwaites, G., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2015. High levels of antimicrobial resistance among escherichia coli isolates from livestock farms and synanthropic rats and shrews in the Mekong Delta of Vietnam. Appl Environ Microbiol 81. pp. 812-820.
25. Al-Kobaisi, M.F., 2007. Jawetz, Melnick & Adelberg’s Medical Microbiology 24th Edition. Sultan Qaboos University Medical Journal [SQUMJ] 7, 273-275. 26. Chu, V.T., Tran, T.M.T., Vu, D.M., Pham, T.T., Khuc, T.S., Tran, T.H., Nguyen,
T.L., Nguyen, T.K.C., Do, V.T., Nguyen, T.T.H., 2016. Study on residues of antibiotics and beta-agonistin fresh meat (pork, chicken meat) and pig urine at slaughterhouses in some Northern provinces, Viet Nam. Veterinary Sciences and Techniques 23. pp. 76-84.
27. DEid, S., Nasef, S., Erfan, A., 2015. Multidrug resistant bacterial pathogens in eggs collected from backyard chickens. Assiut Vet. Med. J. Vol. 61 No 144. pp. 87-103. 28. Hamid, S., 2016. Insight into Chicken Egg Proteins and Their Role in Chemical
Defense Mechanism. International Journal of Poultry Science 15. pp. 76-80. 29. Jonchère, V., Réhault-Godbert, S., Hennequet-Antier, C., Cabau, C., Sibut, V.,
Cogburn, L.A., Nys, Y., Gautron, J., 2010. Gene expression profiling to identify eggshell proteins involved in physical defense of the chicken egg. BMC Genomics 11. pp. 57.
30. Maciuca, I.E., Cummins, M.L., Cozma, A.P., Rimbu, C.M., Guguianu, E., Panzaru, C., Licker, M., Szekely, E., Flonta, M., Djordjevic, S.P., Timofte, D., 2019. Genetic Features of mcr-1 Mediated Colistin Resistance in CMY-2-Producing Escherichia coli From Romanian Poultry. Frontiers in Microbiology 10.
31. Nguyen, N.T., Nguyen, H.M., Nguyen, C.V., Nguyen, T.V., Nguyen, M.T., Thai, H.Q., Ho, M.H., Thwaites, G., Ngo, H.T., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2016. Use of Colistin and Other Critical Antimicrobials on Pig and Chicken Farms in Southern Vietnam and Its Association with Resistance in Commensal Escherichia coli Bacteria. Applied and Environmental Microbiology 82. pp. 3727.
32. Nguyen, V.T., Carrique-Mas, J.J., Ngo, T.H., Ho, H.M., Ha, T.T., Campbell, J.I., Nguyen, T.N., Hoang, N.N., Pham, V.M., Wagenaar, J.A., Hardon, A., Thai, Q.H., Schultsz, C., 2015. Prevalence and risk factors for carriage of antimicrobial-resistant Escherichia coli on household and small-scale chicken farms in the Mekong Delta of Vietnam. The Journal of antimicrobial chemotherapy. 70. pp. 2144-2152.
33. Nhung, N.T., Cuong, N.V., Campbell, J., Hoa, N.T., Bryant, J.E., Truc, V.N., Kiet, B.T., Jombart, T., Trung, N.V., Hien, V.B., Thwaites, G., Baker, S., Carrique-Mas, J., 2015. High levels of antimicrobial resistance among escherichia coli isolates from livestock farms and synanthropic rats and shrews in the Mekong Delta of Vietnam. Appl Environ Microbiol 81. pp. 812-820.
34. Okorie-Kanu, O.J., Ezenduka, E.V., Okorie-Kanu, C.O., Ugwu, L.C., Nnamani, U.J., 2016. Occurrence and antimicrobial resistance of pathogenic Escherichia coli and Salmonella spp. in retail raw table eggs sold for human consumption in Enugu state, Nigeria. Vet World 9, 1312-1319.
35. Quesada, A., Ugarte-Ruiz, M., Iglesias, M.R., Porrero, M.C., Martínez, R., Florez-Cuadrado, D., Campos, M.J., García, M., Píriz, S., Sáez, J.L., Domínguez, L., 2016. Detection of plasmid mediated colistin resistance (MCR-1) in Escherichia coli and Salmonella enterica isolated from poultry and swine in Spain. Research in Veterinary Science 105, 134-135.
36. Rumore, J., Tschetter, L., Kearney, A., Kandar, R., McCormick, R., Walker, M., Peterson, C.L., Reimer, A., Nadon, C., 2018. Evaluation of whole-genome sequencing for outbreak detection of Verotoxigenic Escherichia coli O157:H7 from the Canadian perspective. BMC Genomics 19, 870.
37. Van, T.T., Chin, J., Chapman, T., Tran, L.T., Coloe, P.J., 2008. Safety of raw meat and shellfish in Vietnam: an analysis of Escherichia coli isolations for antibiotic resistance and virulence genes. Int J Food Microbiol 124, 217-223. 38. Wei, W., Srinivas, S., Lin, J., Tang, Z., Wang, S., Ullah, S., Kota, V.G., Feng, Y.,
2018. Defining ICR-Mo, an intrinsic colistin resistance determinant from Moraxella osloensis. PLOS Genetics 14, e1007389.
39. Wellman-Labadie, O., Picman, J., Hincke, M.T., 2008. Antimicrobial activity of cuticle and outer eggshell protein extracts from three species of domestic birds. Br Poult Sci 49, 133-143.
40. uong, T.T., Nguyen, V.L., 2015. Survey on Antibiotics for Porker and Broiler Chicken in Commercial Farm in Bac Giang Province. J. Sci. & Devel. 13. pp. 717-722.
PHỤ LỤC 1
Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi gia cầm trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận
Tiêu chí Số hộ chăn nuôi gia cầm (n = 50)
Sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Trang
trại Tỷ lệ (%) Có 50 100 Mục đích sử dụng kháng sinh Trị bệnh 12 24 Phòng bệnh 23 46 Tăng trọng 0 0,00 Kết hợp phòng và trị bệnh 15 30 Lựa chọn kháng sinh
Theo kinh nghiệm 10 20
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất 21 42 Theo đơn của bác sĩ thú y 19 38
Quyết định liều lượng kháng sinh
Theo kinh nghiệm 8 16
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất 24 48 Theo đơn của bác sĩ thú y 18 36
Phối hợp kháng sinh
Theo kinh nghiệm 5 10
Theo hướng dẫn của nhà sản xuất 20 40 Theo đơn của bác sĩ thú y 25 50
Thời gian ngừng sử dụng thuốc trước khi xuất chuồng
Theo kinh nghiệm 28 56