Chồi ghép Phƣơng pháp ghép Tỷ ệ bật ầ sau 30 ngày(%) Tỷ ệ ắt ghép xanh sau 10 ngày (%) Thời gian bật ầ sau cấy (ngày) Chất ƣợng chồi Nêm 15,3 22,2 21 + Cam Vân Du Chữ T 0 21,3 0 0 Hàm ếch 14,9 18,7 23 + Nêm 16,7 33,3 25 + Cam Sunkit Chữ T 0 17,6 0 0 Hàm ếch 18,4 26,7 24 + Cam V2 Nêm 13,3 38,4 20 ++ Chữ T 0 20 0 0 Hàm ếch 23,3 32,6 22 ++
Chú thích: (+)-chồi xanh nhạt, (++)-chồi xanh đậm
Tƣơng tự khi vi ghép đỉnh sinh trƣởng cam trên gốc ghép quất thì phƣơng pháp ghép hàm ếch và phƣơng pháp ghép nêm có tỉ lệ thành công cao hơn phƣơng pháp ghép chữ T ngƣợc. Tỷ lệ mắt ghép xanh sau 10 ngày của phƣơng pháp ghép nêm là cao nhất với 38,4% đồi với giống cam V2, sau đó lần lƣợt là giống cam Sunkit và giống Vân Du.
sử dụng kính lúp nhiều nên dễ nhiễm nấm, đồng thời tốn nhiều thời gian do đó tỷ lệ mắt ghép xanh và tỷ lệ bật mầm thấp hơn so với phƣơng pháp ghép nêm, thời gian bật mầm sau cấy lâu hơn cách ghép nêm, cần từ 22-24 ngày.
Nhƣ vậy, qua 2 bảng số liệu ta thấy rằng gốc ghép bƣởi cho tỉ lệ mắt ghép sống cao hơn gốc ghép quất. Mặc dù phƣơng pháp ghép nêm cho tỷ lệ mắt ghép xanh sau 10 ngày khá cao, tuy nhiên chồi bị hóa nâu và chết nhiều sau 20 ngày so với phƣơng pháp ghép hàm ếch ở cả 2 loại gốc ghép.
Qua so sánh nhận thấy, giữa 3 giống cam thì giống cam V2 cho hiệu quả ghép tốt nhất, tiếp sau là giống cam Sunkit và kém nhất là giống cam Vân Du.
Hình 4.9. Vi ghép ca V2 trên gốc quất theo phƣơng pháp ghép hà ếch sau 10 ngày (bên trái), sau khi nảy ầ đƣợc 20 ngày (phải)
Hình 4.10. Vi ghép ca Vân Du trên gốc quất theo phƣơng pháp ghép nê sau 10 ngày (bên trái), sau khi nảy ầ đƣợc 20 ngày (phải)
Hình 4.11. Vi ghép cam Vân Du trên gốc bƣởi theo phƣơng pháp ghép nê sau 10 ngày (bên trái), sau khi nảy ầ đƣợc 20 ngày (phải)
Hình 4.12. Vi ghép ca V2 trên gốc bƣởi theo phƣơng pháp ghép hà ếch ghép sau 10 ngày ghép (trái), sau 20 ngày bật ầ (phải)
4.8. NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG ĐẾN TỶ LỆ RA RỄ CỦA CÂY VI GHÉP RỄ CỦA CÂY VI GHÉP
Theo Farooq et al. (2008), auxin có vai trò trong việc tạo rễ ở môi trƣờng tạo rễ in vitro, thông qua ảnh hƣởng của nó đến sự phân chia tế bào và hình thành rễ đầu tiên. NAA là chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin, đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trƣởng và dãn nở của tế bào, tăng cƣờng quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích sự hình thành rễ.
Dựa trên những đặc tính của NAA, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của NAA đến sự phát sinh rễ cây vi ghép. Thí nghiệm đƣợc tiến hành trên 4 công thức có bổ sung α-NAA ở các nồng độ khác nhau. Cây sau vi ghép, bật chồi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS chứa nồng độ NAA khác nhau nhƣ công thức sau. Theo dõi sau 5 tuần cấy chuyển thu đƣợc kết quả nhƣ bảng dƣới đây:
Bảng 4.16. Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ ệ ra rễ của cây vi ghép giống ca Vân Du CT Hà ƣợng NAA (mg/l) Tỷ ệ ẫu ra rễ (%) Số rễ TB/chồi Chiều dài rễ Chất ƣợng rễ 1 0 0 0 0 0 2 0,5 11,3 0,5 0,4 + 3 1 16,7 0,9 0,9 ++ 4 1,5 14,5 0,5 0,5 +
(+) Rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu / (++) Rễ dài, trắng, có lông hút
Kết quả cho thấy, α-NAA kích thích việc hình thành rễ cây cam trong nuôi
cấy in vitro. So với công thức đối chứng, ba công thức có bổ sung α-NAA đều cho
các chỉ số theo dõi cao hơn, trong đó công thức bổ sung 1 mg/l NAA có tỷ lệ ra rễ thành công cao nhất là 16,7 %, số rễ trung bình/chồi đạt 0,91 và chiều dài rễ cũng đạt cao nhất với 0,9 cm ở tuần thứ 4. Cam Vân Du có tỷ lệ mẫu tạo rễ và số rễ/mẫu tăng dần trong phạm vi từ 0,5 -1 mg/l NAA, khi tăng nồng độ lên 1,5 mg/l NAA thì tỷ lệ mẫu tạo rễ giảm xuống còn 14,5% và số rễ trung bình chỉ còn 0,5 cm. Nguyên nhân là do khi tăng nồng độ α-NAA vƣợt quá sẽ kích thích hình thành mô sẹo, ức chế việc hình thành rễ.
Nhƣ vậy bổ sung α-NAA nồng độ 1mg/l cho tỷ lệ mẫu cam Vân Du hình thành rễ cao nhất, số rễ trung bình/mẫu cao nhất, rễ dài, khỏe và có lông hút.
Bảng 4.17. Ảnh hƣởng của ôi trƣờng đến tỷ ệ ra rễ của cây vi ghép giống ca Sunkit CT Hà ƣợng NAA (mg/l) Tỷ ệ ẫu ra rễ (%) Số rễ
TB/chồi Chiều dài rễ
Chất ƣợng rễ 1 0 0 0 0 0 2 0,5 8,3 0,6 0,6 + 3 1 17,7 1,1 0,8 ++ 4 1,5 13,4 0,9 0,9 +
(+) Rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu / (++) Rễ dài, trắng, có lông hút
Tƣơng tự đối với cam Vân Du, số mẫu hình thành rễ và số rễ/mẫu tăng dần khi bổ sung NAA trên giống cam Sunkit trong khoảng từ 0,5-1 mg/l. Tăng đến mức 1,5 mg/l tỷ lệ mẫu hình thành rễ giảm chỉ còn 13,4%, số rễ TB/ mẫu cũng giảm còn 0,88 và chất lƣợng rễ không tốt, rễ ngắn, nhỏ, có phần bị hóa nâu.
Theo nhiều tác giả, khi nồng độ NAA quá cao, rễ có hiện tƣợng sùi to mà không phát triển về chiều dài, có nhiều chỗ bị hóa nâu, phần gốc chồi bị sùi tỏa làm ảnh hƣởng đến khả năng sống của cây khi đƣa ra vƣờn ƣơm. Nguyên nhân có thể là do chất lƣợng rễ không tốt nên khả năng hút chất dinh dƣỡng của cây giảm xuống làm chồi phát triển kém hơn, chiều cao chồi giảm.
Bảng 4.18 . Ảnh hƣởng của ôi trƣờng đến tỷ ệ ra rễ của cây vi ghép giống cam V2 CT Hà ƣợng NAA (mg/l) Tỷ ệ ẫu ra rễ (%) Số rễ TB/chồi chiều dài rễ Chất ƣợng rễ 1 0 0 0 0 0 2 0,5 14,7 1 1,3 + 3 1 22,3 1,4 1,8 ++ 4 1,5 20,6 0,9 2,1 +
Tƣơng tự nhƣ đối với cam Vân Du và cam Sunkit, α-NAA đƣợc bổ sung ở các nồng độ 0,5 ; 1 và 1,5 mg/l trên cam V2 cho thấy các chỉ tiêu theo dõi về rễ hiệu quả hơn so với công thức đối chứng và các chỉ số về rễ đạt tốt nhất ở mức 1 mg/l α-NAA sau 4 tuần theo dõi.
Đối với chỉ tiêu chiều dài rễ, qua theo dõi cho thấy chiều dài rễ đạt cao nhất với 2,1cm, tuy nhiên rễ mảnh, nhỏ, ngắn, không dài và có nhiều lông hút nhƣ ở mức bổ sung 1mg/l α-NAA. Số rễ TB/chồi ở mức 1,5mg/l cũng chỉ đạt 0,9 thâp hơn khá nhiều so với mức 1mg/l (đạt tới 1,4 rễ TB/chồi).
Từ 3 bảng số liệu trên cho thấy, Giống cam V2 cho thấy hiệu quả của NAA trong quá trình ra rễ là tốt nhất, với tỷ lệ mẫu ra rễ lên tới 22,3%, rễ dài và có lông hút, khỏe, số rễ trung bình/chồi lên tới 1,4. Trong khi 2 giống cam Vân Du và Sunkit cho hiệu quả ra rễ kém hơn, nhƣng không thấy sự khác biệt quá rõ rệt.
Nhƣ vậy, với cả 3 giống cam Vân Du, Sunkit và V2 làm thí nghiệm, khi nồng độ α-NAA tăng lên từ 1-1,5mg/l thì tỷ lệ ra rễ tăng lên, dao động từ 13,4%-22,3%. Điều này cũng rất phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây của tác giả Nguyễn Thanh Nhàn (2004): Khi nồng độ α-NAA cao sẽ kích thích sự hình thành rễ.
Với nồng độ 1mg/l α-NAA bổ sung vào môi trƣờng MS là nồng độ phù hợp nhất cho sự hình thành, phát sinh và phát triển rễ đồng thời chất lƣợng cây vi ghép đạt tốt nhất.
So sánh với kết quả nghiên cứu của tác giả Lã Thị Nguyệt (2008), nhận thấy có sự tƣơng tự : sau 4 tuần nuôi cấy, bổ sung 1mg/l α-NAA là nồng độ thích
hợp nhất cho sự phát triển, hình thành rễ in vitro của chồi bƣởi Diền và cam Xã
Đoài, đồng thời chất lƣợng cây trong điều kiện này đạt tốt nhất.
4.9. KẾT QUẢ KIỂM TRA BỆNH CỦA CÁC CÂY VI GHÉP
Để đánh giá về tính sạch bệnh Greening của các cây cam vi ghép, chúng tôi tiến hành giám định qua phƣơng pháp PCR sử dụng cặp mồi A2/J5. Mẫu lá đƣợc cắt từ các cây cam vi ghép, bảo quản lạnh và nghiền mẫu để tách chiết ADN sử dụng cho PCR. Kết quả kiểm tra cho thấy tất cả các mẫu đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ sự sạch bệnh Greening trên các cây vi ghép.
Bảng 4.19. Kết quả kiể tra phát hiện vi khuẩn Ca. Liberibacter asiaticus
(bệnh Huang ongbing = Greening) trên cây ca vi ghép
STT Mẫu PCR Cặp mồi A2 và J5 1 Cam 1- Vân Du - 2 Cam 2- Sunkit - 3 Cam 3- V2 - 4 Cam 4 – V2 - 5 Cam 5- V2 - 6 Đ/c dƣơng +
Hình 4.14. Kết quả kiể tra bệnh trên cây sau vi ghép
Dựa vào thang chuẩn của dung dịch marker và mẫu đối chứng để kiểm tra kết quả cho thấy: M là thang DNA 1 kb (GenRuler 1 kb, Thermo Scientific) với băng tham khảo 750 bp. Các giếng mẫu là từ 1 đến 5, tất cả đều cho vạch màu tối, chứng tỏ âm tính với vi khuẩn Ca. Liberibacter asiaticus, công thức đối chứng cho vạch màu sáng, dƣơng tính với tác nhân gây bệnh.
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
Sau quá trình tiến hành các thí nghiệm chúng tôi rút ra đƣợc một số kết luận nhƣ sau:
1. Khi tăng thời gian xử lí cồn 700 từ 1 đến 9 phút thì tỉ lệ mẫu nhiễm cũng
giảm xuống. Tỷ lệ nảy mầm của hạt bƣởi đạt cao nhất khi khỉ trùng bằng cồn 700
trong 7 phút ở hạt quất chỉ đạt 36,8%. Bên cạnh đó, tỷ lệ mẫu nhiễm của hạt bƣởi vẫn nhỏ hơn hạt quất do hạt quất có lớp màng nhầy bên ngoài rất khó bóc tách. Với ba dung dịch khử trùng còn lại vẫn chƣa đạt đƣợc hiệu quả cao khi sử dụng. Để phá ngủ và rút ngắn thời gian nảy mầm của hạt gốc ghép cần bổ sung 80mg/l
GA3 vào môi trƣờng MS, từ 35 ngày xuống 22 ngày đối với hạt quất; từ 30 ngày
xuống 22 ngày đối với hạt bƣởi.
2. Đối với việc khử trùng các đoạn cành giâm cho thấy Presept cho thấy hiệu quả kém nhất trong việc khử trùng trên cả ba đối tƣợng cành giâm. Xử lý HgCl2 0,1% trong 15 phút cho hiệu quả khử trùng tốt nhất đối với việc khử trùng giống cam Vân Du và Sunkit, trong khi Javen 5% trong 15 phút lại tỏ ra hiệu quả với giống cam V2. Khi bổ sung vào môi trƣờng MS 1mg/l BAP đối với cam Sunkit và cam V2; bổ sung 1,5 mg/l BAP đối với cam Vân Du, cho thấy tác dụng tích cực đối với sự bật mầm và chất lƣợng chồi, giúp cây phát triển to, khỏe, lá xanh đậm.
3. Nếu sử dụng gốc ghép quá non (2 tuần tuổi) hoặc quá già (5 tuần tuổi) cho tỷ lệ cây vi ghép sống thấp hơn so với gốc ghép từ 3-4 tuần tuổi. Ngoài ra, kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng có ảnh hƣởng đến hiệu quả quá trình vi ghép. Vi ghép với đỉnh sinh trƣởng 1mm là quá nhỏ, do đó cây vi ghép không thể tái sinh chồi và bị chết. Khi tiến hành vi ghép ở đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc 3mm cho thấy hiệu quả tốt nhất, trên cả ba giống cam nghiên cứu. Phƣơng pháp ghép hàm ếch cho hiệu quả ghép cao nhất, hai phƣơng pháp ghép nêm và ghép chữ T cho hiệu quả kém hơn. Giữa 3 giống cam thì giống V2 cho hiệu quả ghép tốt nhất, tiếp sau là giống cam Sunkit và kém nhất là giống cam Vân Du. Môi trƣờng ra rễ cho kết quả tốt nhất với cả 3 giống cam thí nghiệm là bổ sung 1ml α -NAA/l vào môi trƣờng nuôi cây vi ghép.
4. Kết quả cho thấy sự thành công của vi ghép khi 100% mẫu lá cây vi ghép đem test đều cho kết quả âm tính với bệnh Greening, cây sạch bệnh, sinh trƣởng tốt.
5.2. KIẾN NGHỊ
1. Ứng dụng các kết quả nghiên cứu trong nhân nhanh invitro từ hạt bƣởi và hạt quất nhằm tạo nguồn vật liệu khởi đầu cho công tác giống.
2.Tiếp tục các nghiên cứu tạo cụm chồi cho các giống cây có múi khác để tìm ra quy trình nhân nhanh hoàn chỉnh cho chi Citrus nói chung.
3. Tiếp tục các nghiên cứu về phƣơng pháp vi ghép trong nhân giống cây có múi nhằm mục tiêu tạo giống cây có múi sạch bệnh, phục vụ trong sản xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tiếng Việt:
1. Bùi Huy Đáp (1960). Cây ăn quả nhiệt đới tập I, cam quýt, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
2. Đào Thanh Vân và Ngô Xuân Bình (2003). Giáo trình cây ăn quả (dành cho cao học), Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Đỗ Đình Ca và Lê Công Thanh (2006). Ảnh hƣởng của GA3 đến năng suất, phẩm chất cam Xã Đoài, Báo cáo kết quả thực hiện đề tài, Viện Nghiên cứu Rau quả. 4. Đỗ Năng Vịnh (2008). Công nghệ sinh học chọn tạo giống cây ăn quả có múi.
Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Đỗ Tiến Phát, Nguyễn Chi Mai, Đặng Hòa Hiếu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà và Lê Trần Bình (2007). Xây dựng quy trình tái sinh đa chồi trực tiếp từ thân mầm cây cam sành (Citrus nobilis loureiro) phục vụ chuyển gen. Tạp chí Công nghệ Sinh học, tr. 363- 370.
6. Đỗ Văn Nam, Nguyễn Thị Bích Hồng, Phạm Thị Ngọc, Nguyễn Văn Hoan và Nguyễn Thị Phƣơng Thảo (2013). Nhân giống vô tính invitro cây đu đủ Carica papapaya L. Tạp chí Khoa học và Phát triển. 11 (6).Tr. 833-839.
7. Đƣờng Hồng Dật (2003). Cam, chanh, quýt, bƣởi và kỹ thuật trồng, Nhà xuất bản Lao động và xã hội, Hà Nội.
8. Dƣơng Tấn Nhựt (2011). Công nghệ sinh học thực vật: Nghiên cứu cơ bản và ứng dụng. Tập 1. Nhà xuất bản Nông nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh.
9. Hà Minh Trung, Ngô Vĩnh Viễn, Lê Mai Nhất, Mai Thị Liên và Nguyễn Thị Bích Ngọc (2008). Hoàn thiện và ứng dụng công nghệ sản xuất cây có múi đ c sản (cam, quýt, bƣởi) sạch bệnh greening và các bệnh virus khác ở các tỉnh phía Bắc. Tuyển tập công trình nghiên cứu và chuyển giao khoa học công nghệ. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
10. Hà Thanh Võ (2005). Nghiên cứu kĩ thuật vi ghép Bƣởi. Khóa luận tốt nghiệp. Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh.
11. Hà Thị Thúy và Đỗ Năng Vịnh (2004). Nghiên cứu tạo mô sẹo phôi hóa và phôi vô tính từ nuôi cấy noãn ở một số giống cây ăn quả có múi, Tạp chí Di truyền và Ứng dụng, tr.13-19.
12. Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch và Vũ Quang Sáng (2008). Giáo trình Sinh lí thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
13. Hoàng Ngọc Thuận (1994). Một số kết quả nghiên cứu về gốc ghép nhân vôtính cho cam quýt ở vung đồng bằng Sông Hồng, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nôi, tr. 54 – 57.
14. Hoàng Thị Thủy (2015). Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số biện pháp kỹ thuật đối với nguồn thực liệu tạo quả không hạt cây có múi. Luận án tiến sĩ nông nghiệp. Đại học Thái Nguyên.
15. Hoàng Thị Xuân (2017). Nghiên cứu nhân giống cây bƣởi Diễn bằng kĩ thuật nuôi cấy invitro. Luận văn thạc sỹ sinh học, Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên.
16. Hoàng Trung Kỳ (2011). Nghiên cứu các biện pháp làm tăng tỷ lệ thành công vi ghép đỉnh sinh trƣởng mục đích làm sạch bệnh vàng lá Greening trên cây Cam Canh. Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội. tr. 46-60.
17. Lã Thị Nguyệt (2008). Nghiên cứu tạo dòng bƣởi Diễn và cam Xã Đoài đa bội bằng xử lý colchicine trong điều kiện invitro. Luận văn thạc sỹ nông nghiệp, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. tr. 31-52.
18. Lê Mai Nhất (2014). Nghiên cứu bệnh vàng lá greening hại cây ăn quả có múi ở một số tỉnh phía Bắc Việt Nam và đề xuất biện pháp phòng chống. Luận án tiến sĩ, Viện khoa học nông nghiệp Việt Nam.
19. Lê Thị Thu Hồng (2000). Nghiên cứu một số biện pháp Bảo vệ thực vật trong sản xuất cây giống có múi ở đồng bằng song Cửu Long. Luận án tiến sĩ, Viện Khoa