a. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc thiết kế ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức đƣợc bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình chứa 5 cây.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu công thức khử trùng các loại hạt bưởi, quất.
- Hạt bƣởi và quất đƣợc tách từ các quả chín, sạch bệnh và rửa sạch nhớt, phơi khô nơi thoáng gió, ánh sáng tán xạ. Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm tiến hành ngâm hạt trong thuốc diệt nấm Cabenzin 0.2% trong khoảng từ 5-10 phút. Sau đó rửa kĩ lại bằng nƣớc cho đến khi sạch nhớt.
- Hạt đƣợc khử trùng bằng cồn 700 và các chất khử trùng khác theo các công thức nhƣ sau:
-CT1: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời gian 1phút -CT2: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 3 phút -CT3: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 5 phút -CT4: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 7 phút -CT5: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 9 phút -CT6: Khử trùng bằng Javen trong 15 phút -CT7: Khử trùng bằng Presept 5% trong 15 phút -CT8: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút.
- Sau khi khử trùng theo các công thức trên, hạt đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Các thao tác đều đƣợc thực hiện trong buồng cấy.
- Tiến hành bóc vỏ hạt và cấy vào môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar. Tiến hành theo dõi tỷ lệ mẫu sạch, mẫu bị nhiễm sau 7 ngày cấy hạt để xác định công thức khử trùng tốt nhât.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt gốc ghép
Do GA3 là chất điều hòa sinh trƣởng không bền với nhiệt nên đƣợc bổ sung theo các nồng độ vào môi trƣờng MS bằng màng lọc vô trùng Fitech có kích thƣớc lỗ lọc 0,2 µm. Hạt đƣợc khử trùng theo công thức tối ƣu từ thí nghiệm
1 đƣợc cấy vào các bình môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar và các nồng độ GA3 theo các công thức sau:
CT1: CT đối chứng, không sử dụng GA3 CT2: Sử dụng GA3 với nồng độ 20 mg/l CT3: Sử dụng GA3 với nồng độ 40 mg/l CT4: Sử dụng GA3 với nồng độ 60 mg/l CT5: Sử dụng GA3 với nồng độ 80 mg/l CT6: Sử dụng GA3 với nồng độ 100 mg/l.
Các bình sau khi cấy cho vào buồng tối 7 ngày rồi cho ra phòng sáng, nuôi trong điều kiện ánh sáng 16.000 lux, 16 giờ chiếu sáng, nhiệt độ phòng ổn định 250
C.
Tiến hành theo dõi và đếm tỷ lệ nảy mầm, sức nảy mầm của hạt theo các môi trƣờng thí nghiệm.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu phương pháp khử trùng phù hợp đối với đoạn cành giâm chuẩn bị chồi ghép.
- Mẫu cành đƣợc cắt từ các giống cam Vân Du, V2, Sunkit đã thu thập trồng trong nhà lƣới. Sau đó, các mẫu cành đƣợc rửa sạch bằng xà phòng và ngâm vào trong dung dịch thuốc diệt nấm Cabenzin 0,2% trong 10 phút, sau đó đƣợc rửa sạch bằng xà phòng dƣới vòi nƣớc chảy.
- Sau đó mẫu đƣợc cắt ngắn thành đoạn 5cm và đánh dấu mẫu giống rồi
đƣa vào buồng cấy khử trùng qua cồn 700 trong 3 phút. Tiến hành rửa sạch mẫu
bằng nƣớc cất 3 lần rồi tiếp tục xử lí bằng dung dịch diệt khuẩn sau. Mỗi công thức xử lý trong 10 phút:
CT1: Khử trùng cành giâm bằng Javen 5% CT2: Khử trùng cành giâm bằng Presept 5%
CT3: Khử trùng cành giâm bằng HgCl2 0,1%.
Sau đó tiến hành rửa các mẫu cành bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần rồi giâm cành vào môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar để trong phòng sáng (điều kiện ánh sáng 16.000 lux, 16 giờ chiếu sang), nhiệt độ phòng ổn định 250C.
Tiến hành theo dõi tỷ lệ mẫu sạch, mẫu bị nhiễm sau 7 ngày giâm cành để xác định công thức khử trùng tốt nhất.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ bật mầm của chồi ghép.
-Thí nghiệm trên 3 giống cam: Vân Du, Sunkit,V2 đƣợc khử trùng theo các phƣơng pháp ở thí nghiệm 3. Các mẫu cành đƣợc giâm vào môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar với các công thức sau:
CT1: CT đối chứng CT2: MS+ 0,5 mg/l BAP CT3: MS+ 1 mg/l BAP CT4: MS+ 1,5 mg/l BAP CT5: MS+ 2 mg/l BAP CT6: MS+ 2,5 mg/l BAP
Các bình nuôi cấy để trong phòng sáng (điều kiện ánh sáng 16.000 lux, 16 giờ chiếu sang), nhiệt độ phòng ổn định 250C. Tiến hành theo dõi số ngày bật mầm đầu tiên, tỷ lệ bật mầm của cành giâm của các công thức thí nghiệm.
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tuổi gốc ghép bưởi đến tỷ lệ sống của vi ghép
- Các gốc ghép đƣợc nuôi cấy từ hạt quất và bƣởi. Sau 1-4 tuần tuổi bật mầm, gốc ghép đƣợc tiến hành vi ghép với đỉnh sinh trƣởng của 3 giống cam: Cam Vân Du, cam Sunkit, cam V2. Mỗi công thức tiến hành trên 10 cây, lặp lại 3 lần.
CT1: Gốc ghép 2 tuần tuổi CT2: Gốc ghép 3 tuần tuổi CT3: Gốc ghép 4 tuần tuổi CT4: Gốc ghép 5 tuần tuổi
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của kích thước đỉnh sinh trưởng đến tỷ lệ sống của vi ghép.
- Đỉnh sinh trƣởng của 3 giống: Cam Vân Du, cam Sunkit, cam V2đƣợc cắt với kích thƣớc theo các công thức sau. Mỗi công thức tiến hành trên 10 cây, lặp lại 3 lần. Sau khi ghép tính tỷ lệ sống của các công thức đối với từng giống cam.
CT1: Đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc 1 mm CT2: Đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc 3 mm CT3: Đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc 5 mm
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của phương pháp ghép đến tỷ lệ nảy mầm của mắt ghép.
-Các thao tác đƣợc thực hiên dƣới điều kiện vô trùng.
-Dụng cụ ghép cần: kính lúp soi nổi, dao nhọn, nhíp, que cấy, đ n cồn, giấy vô trùng.
-Tiêu chuẩn của mầm ghép: Đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc nhỏ đƣợc tách từ các chồi mầm bật lên từ đoạn cành giâm vô trùng ở thí nghiệm 4.
-Tiêu chuẩn của gốc ghép: có tuổi thọ từ 14-20 ngày sau khi bật mầm, tốt nhất là 14-16 ngày.
- Chuẩn bị gốc ghép: Dùng dao cắt ngang thân gốc ghép cách nách lá khoảng 5- 7cm, cắt dứt khoát, vết cắt bằng, ngọt.
- Phƣơng pháp ghép: Tiến hành theo 3 phƣơng pháp: Cắt hình chữ T ngƣợc, kiểu nêm và hàm ếch, vết cắt đạt độ chính xác cao.
- Dùng panh đƣa mầm ghép vào khít vết bổ trên gốc ghép. Trƣớc khi ghép chà lên vết cắt gốc ghép một chút agar để hỗ trợ hiệu quả trong sự tiếp xúc giữa chồi ghép. Cắt ngắn lại bộ rễ chỉ để khoảng 3-4cm.
- Cấy chuyển môi trƣờng và nuôi cấy trong điểu kiên vô trùng. Tiến hành theo dõi hàng ngày để kiểm tra mắt ghép sống và tỷ lệ bật mầm.
-Thí nghiệm tiến hành trên 2 loại gốc ghép, gồm gốc quất và gốc bƣởi -Thí nghiệm vi ghép đỉnh sinh trƣởng trên cành cam của 3 giống: Cam Vân Du, cam Sunkit, cam V2
CT1: Ghép nêm CT2: Ghép chữ T CT3: Ghép hàm ếch
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép.
- Cây sau vi ghép, bật chồi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS + 6,5g agar/l + 30 g/l sucorose chứa nồng độ NAA khác nhau nhƣ công thức sau:
CT1: Đối chứng
CT2: MS + 0,5mg/l α-NAA. CT3: MS + 1 mg/l α-NAA
CT4: MS + 1,5mg/l α-NAA
Mỗi công thức tiến hành trên 5 cây. Theo dõi tỷ lệ ra rễ sau thời gian 1- 4 tuần.
Thí nghiệm 9. Giám định bệnh trên các mẫu cây vi ghép
Phƣơng pháp giám định theo Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
PCR dùng cặp mồi A2/J5 (Hocquellet et al., 1999) để phát hiện vi khuẩn
Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca.Las).
Chiết DNA từ mẫu cây
DNA tổng số từ mẫu cam đƣợc chiết theo phƣơng pháp chiết nhanh
bằng NaOH (Wang et al., 1993). Toàn bộ gân chính của lá đƣợc nghiền trong
400 µL NaOH 0.5 M bằng chày và cối sứ sạch. Tiếp theo 5 µL của dịch nghiền đƣợc hòa trong 50 µL đệm Tris 0.1 M, pH8 và đƣợc sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.
Mồi PCR
Hai bộ mồi PCR đặc hiệu vi khuẩn Ca.Las đã đƣợc sử dụng là: A2 (TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT) và
J5 (ACAAAAGCAGAAATAGCA CGAACAA‟).
Cặp mồi này tạo sản phẩm 750 bp (Hocquellet et al., 1999)
Phản ứng PCR
Các phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong tube 0,2 µl với tổng thể tích là 15 µl, thành phần của mỗi phản ứng PCR nhƣ sau:
Thành phần Thể tích (µ )
H2O 6.4
GoTaq Green Master mix (2x) 7.5
Mồi xuôi dòng (20 µM) 0.3
Mồi ngƣợc dòng (20 µM) 0.3
DNA 0.5
+ Quy trình thực hiện phản ứng PCR 94oC 2 phút x 1 94oC 30 giây 54oC 30 giây x 35 72oC 1 phút 72oC 4 phút X 1 25oC 10 phút x 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1 % đƣợc chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide.
b. Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu đánh giá gốc ghép và chồi ghép:
- Tỷ lệ nảy mầm của hạt, % = (Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt đem gieo)x 100.
- Tỷ lệ mẫu nhiễm, % = (Số mẫu bị nhiễm/ Tổng số mẫu đem cấy)x 100
- Ngày bật mầm đầu tiên của hạt, chồi: Đánh dấu ngày bật mầm đầu tiên
của hạt, chồi kể từ ngày nuôi cấy đối với từng công thức thí nghiệm.
- Số ngày bật mầm sau cấy: Tính từ khi cấy đến hạt, chồi đầu tiên nảy mầm
- Chiều dài, đƣờng kính của thân gốc ghép, thân chồi mới bật: Dùng thƣớc
panme đã tiệt trùng tiến hành đo cách gốc 0,5cm.
Các chỉ tiêu theo dõi sau vi ghép:
- Tỷ lệ mắt ghép sống(%) = (Số mắt ghép sống x 100)/ Tổng số mắt ghép.
- Tỉ lệ nảy mầm sau ghép(%)= (Số mắt ghép nảy mầm x 100)/Tổng số mắt
ghép sống.
Chồi mới đƣợc hình thành: là chồi mới bật lên từ chồi ghép ban đầu khi cây vi ghép còn sống.
+ Chiều cao, đƣờng kính chồi cây vi ghép (mm): Dùng thƣớc panme đã tiệt trùng tiến hành đo chiều cao, đƣờng kính của chồi cây vi ghép.
+ Tốc độ tăng trƣởng chiều cao: Tiến hành theo dõi 7 ngày/lần.
+ Số lá của chồi ghép: Số lá của chồi ghép là số lá có trên chồi ghép của
Tốc độ ra lá (lá/7 ngày): Tiến hành theo dõi 7 ngày/lần.
c. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN