Kỹ thuật vi ghép đỉnh sinh trƣởng (Microshoot tip grafting) đƣợc Murashige áp dụng lần đầu tiên vào năm 1972 sau đó đƣợc cải tiến hoàn chỉnh hơn bởi Navarro (1993) and Hong Ji Su (1984).
Lần đầu tiên, Shahid A.K.. (2011) đã vi ghép thành công đỉnh sinh trƣởng có 4 – 6 phát thể lá trên cây mầm từ hạt dùng làm gốc ghép. Tỉ lệ thành công ghi nhận đƣợc là từ 5 - 40% và tạo đƣợc cây con sạch virus Exocortis. Shahid et al. (2011) ghép chồi ngọn nhỏ hơn với 3 sơ khởi lá của giống Temple tanger lên gốc ghép là cây Troyer cistrange đạt tỉ lệ thành công từ 30 - 50%. Sau đó các cây ghép đƣợc đƣa ra môi trƣờng đất, tỉ lệ cây sống đạt đến 95%. Trên thân cây mầm dùng làm gốc ghép, ông cắt rễ còn dài 4 - 6 cm, thân đƣợc cắt ngang cách lá mầm 1,5 cm. Sau đó ông rạch trên thân cây vết cắt hình chữ T, chồi ghép đƣợc nuôi trong điều kiện vô trùng có chiều dài từ 0,1 - 0,2 mm đƣợc đƣa vào vị trí ghép. Navarro đã thử nghiệm những vị trí ghép khác nhau và theo các kết quả thí nghiệm của ông, vị trí “e” (Hình 1) là vị trí tốt nhất cho sự phát triển của mắt ghép, cũng nhƣ dễ dàng cho việc quan sát sự phát triển của mắt ghép.
Hình 2.1. Các vị trí c thể đƣa đỉnh sinh trƣởng vào gốc ghép
Các vị trí có thể đƣa đỉnh sinh trƣởng vào gốc ghép. Có thể dùng 1 vòng kiềng để giữ mắt ghép dính trên gốc ghép hoặc dùng môi trƣờng agar làm chất kết dính tạm thời bằng cách dùng mũi dao lấy một ít môi trƣờng nuôi cấy để phết lên vị trí ghép. Sau khi ghép, cây đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy trong ống nghiệm 25 x 150 mm chứa 25ml dung dịch môi trƣờng MS lỏng bổ sung 2 mg/l BA. Dùng một tờ giấy thấm đục lỗ ở giữa để giữ gốc ghép không chạm vào thành ống nghiệm, giữ ở 270C, 2000 lux/16h/1ngày. Sau 1 – 2 ngày, nếu mắt ghép còn xanh là tốt. Tiếp tục theo dõi trong 1 tuần, nếu thấy vết ghép liền và đỉnh sinh trƣởng vẫn xanh, có dấu hiệu phát triển là ghép đã đạt yêu cầu. Cây vi ghép sau 6 tuần có thể chuyển ra vƣờn ƣơm, đạt tỉ lệ sống sót 95%.
Anna et al. (2015)thực hiện micrografting sử dụng cherry cv. Van và Regina trên gốc ghép Damil sử dụng các phƣơng pháp ghép khác nhau. Hình chữ V đƣợc gắn vào khe 0,5-0,6 cm trong gốc ghép Damil, trong khi đó, chồi của Regina đƣợc đặt trên gốc ghép Damil. Các mẫu ghép đƣợc đặt riêng lẻ vào các
ống nghiệm trên môi trƣờng WPM với 30 gl -1 sucrose và agar 7gl -1. Tỷ lệ ghép
ghép thành công cao, chồi và gốc ghép đƣợc gắn liền với nhau chặt chẽ và phần trăm di chuyển đơn vị ghép là thấp.
Dobranszki et al. (2000) đã nghiên cứu tìm ra phuơng pháp làm tăng tỷ lệ
sống của cây táo vi ghép và tạo đƣợc điều kiện duy trì sự tiếp xúc tốt giữa gốc và chồi ghép. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nhúng mặt cắt của gốc ghép và chồi ghép vào hỗn hợp acid citric 0.15 mg/l, ascorbic acid 0.1 mg/l và gibberellic acid 0.1 mg/l trƣớc khi ghép sẽ tăng tỷ lệ sống của cây vi ghép lên đến 95%. Một kết quả khác của nhóm là chồi ghép trƣớc khi đặt vào vị trí ghép trên gốc ghép nếu
đƣợc nhúng vào dung dịch agar 0.1% thì khả năng dính của chồi ghép vào gốc ghép tốt hơn, agar làm cho sự dung hợp giữa gốc và chồi ghép tốt hơn cây ghép thích nghi nhanh và đạt tỷ lệ sống 100%.
Muốn chuyển gen vào cây cam, quýt, việc đầu tiên là phải nuôi cấy mô in vitro thành công, đặc biệt là nuôi cấy trụ trên lá mầm (epicotyl). Hussain et al. (2014) kết luận rằng, chuyển gen hiệu quả nhất đối với các giống cam, quýt là chuyển vào trụ trên lá mầm.
Ehsan et al. (2015) đã tiến hành so sánh khả năng tái sinh cây trực tiếp từ các bộ phận nuôi cấy khác nhau của cây Citrus jambhiri Lush, bao gồm: cuống lá, trụ trên lá mầm, rễ và lá mầm của cây con in vitro. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ cảm ứng phát sinh chồi của mẫu cấy là đoạn trụ trên lá mầm cao hơn và có ý nghĩa so với các bộ phận nuôi cấy khác.
Theo Krueger (2003), khi nuôi cấy đoạn trụ trên lá mầm của các giống khác nhau cùng trên môi trƣờng MS có bổ sung nồng độ BA nhƣ nhau nhƣng tỷ lệ tái sinh chồi, số lƣợng chồi ở mỗi giống lại khác nhau.
Theo Almeida et al. (2003), đối với nuôi cấy phát sinh chồi trực tiếp trụ trên lá mầm, chất điều tiết sinh trƣởng BA đƣợc bổ sung vào môi trƣờng MS với nồng độ 1,0 mg/L tỏ ra có ảnh hƣởng tích cực nhất tới sự phát sinh chồi bất định ở nhiều giống cam ngọt (Citrus sinensis) khác nhau...
Rezadost et al. (2013) đã nghiên cứu và xác minh ảnh hƣởng của việc áp
dụng các chất điều chỉnh tăng trƣởng IBA và BAP trong Gala / M-9 và Gala / Marubakaido nhƣ là sự kết hợp giữa gốc ghép. Tỷ lệ cây có thể sống đƣợc để kết
nối các mô mạch, dao động từ 73 đến 93,2%. Tỷ lệ sống sót đƣợc quan sát thấy
cao nhất ở Gala / M-9 (93,2%) đối với môi trƣờng ½ MS bổ sung 2,2 mM IBA, tiếp theo là ½ MS chuẩn bị trƣớc IBA (4 mM) trong cả hai kết hợp cho thấy khả năng sống sót (86,4%). Kết quả cho thấy rằng sử dụng các chất điều tiết sinh trƣởng tại điểm ghép ghép làm tăng đáng kể khả năng sống của ghép.
Tháng 3 năm 2004, trƣờng đại học của California đã thành công khi tiến hành ghép chồi lên gốc cây kháng và đã thu đƣợc kết quả rất tốt cũng nhƣ việc xác định ảnh hƣởng của 2,4 – D, ABA và kinetin lên sự hình thành mô sẹo.
Roistacher (1972) đã xử lý cành ghép ở 500
C bằng hơi nuớc nóng và loại bỏ đƣợc virus gây bệnh “nổ lá”, đồng thời ông cũng chứng minh đƣợc rằng có thể xử lý nhiệt để loại bỏ bệnh lùn cây không rõ nguyên nhân ở cam.
Navarro et al. (1991) chứng minh rằng bệnh loét, bệnh greening và các dòng độc của virus tristeza đều có thể loại bỏ bằng kỹ thuật vi ghép. Năm 1992, Duran và cộng sự đã thành công khi tiến hành vi nhân giống và nuôi cấy mô cây cam ngọt.
Kumar Raj et al. (2003) đã báo cáo ảnh hƣởng của việc xử lý trƣớc các chất điều tiết sinh trƣởng đối với sự thành công của việc lấy ghép ở cây trồng mandarin Nagpur trên gốc chanh thô. Ngay trƣớc khi ghép, cả gốc và chồi đƣợc nhúng trong dung dịch tăng trƣởng trong 10 phút. Các dung dịch thử nghiệm là BA (0.5, 1.0, 2.0 và 5.0 mgl -1), Kinetin (0.5, 1.0, 2.0 và 5.0 mgl -1) và 2,4-D (1.0, 2.0, 5.0 và 10.0 mgl -1). Thành công ghép là cao nhất với Kinetin (1,0 mgl -1) hoặc 2,4-D (10,0 mgl -1).
Starrantino and Caruso tiến hành thí nghiệm micrografting các loài cam quýt với một số các chất tăng trƣởng và quan sát thấy rằng nhúng chồi và gốc trong 10 phút trƣớc khi micrograting trong một dung dịch BA (0,5 ppm) làm tăng tỷ lệ sống từ 73 đến 91%.
Mneney and Mantell (2001) vi ghép chồi đỉnh của các cây điều (Anacardium occidentale L.) trồng trong nhà kính và trồng trong vƣờn lên gốc ghép là cây con in vitro theo 2 phƣơng pháp: ghép bên và ghép trên đỉnh. Ông nhận thấy các phƣơng pháp ghép khác nhau có tác động đến tỉ lệ ghép thành công, phƣơng pháp ghép bên cho tỉ lệ thành công cao hơn. Các vị trí ghép khác nhau trên gốc ghép cũng đƣợc khảo sát. Kết quả cho thấy vị trí ghép không ảnh hƣởng nhiều đến tỉ lệ ghép thành công, nhƣng sau đó, tốc độ tăng trƣởng của chồi ghép có sự khác biệt đáng kể. Ghép trên trục hạ diệp chồi ghép sẽ tăng trƣởng khoẻ hơn, sau 7 tuần, chiều cao của chồi lớn gấp đôi so với ghép trên trục thƣợng diệp. Kết quả khảo sát tác động của các loại chồi ghép cho thấy vị trí ban đầu của chồi ghép trên cây mẹ (chồi bên hoặc chồi đỉnh) không có tác động lớn đến tỉ lệ ghép thành công.
Saini HK et al. (2010) đã khảo sát các phƣơng pháp vi ghép in vitro khác
nhau ở cây hồ trăn. Gốc ghép là các phôi hợp tử đƣợc cho nảy mầm in vitro, chồi ghép là các chồi đỉnh thu nhận từ cây hồ trăn trƣởng thành. Ông đã xem xét tác động của nhiều yếu tố khác nhau lên tỉ lệ ghép thành công nhƣ kích thƣớc chồi ghép, phƣơng pháp ghép, môi trƣờng nuôi cấy và thời gian lấy mẫu. Kết quả cho thấy phƣơng pháp ghép chẻ có tỉ lệ ghép thành công cao nhất và dễ tiến hành
nhất. Khi khảo sát ảnh hƣởng của kích thƣớc chồi ghép, ông nhận thấy tỉ lệ ghép thành công cao khi dùng chồi ghép có chiều dài 2 – 4 mm và 4 – 6 mm, tái sinh từ chồi đỉnh. Khi nuôi cấy trên môi trƣờng không bổ sung chất điều hoà sinh trƣởng, chồi phát triển chậm và các chồi nách không phát triển. Tỉ lệ ghép thành công cao nhất trên môi trƣờng gieo hạt, có bổ sung 2,22 µM BA, 200 mg/l L- ascorbic acid. Các cây con vi ghép in vitro phát triển khoẻ và không gặp vấn đề gì khi đƣa ra vƣờn ƣơm.
Navarro et al. (1975) báo cáo rằng nồng độ sucrose trong môi trƣờng nuôi
cấy cây ghép đã đóng một vai trò quan trọng và là tỷ lệ cao nhất ghép thành công ở các loài cam quýt đã thu đƣợc với 7,5% sucrose.
Jonard et al. (1998) báo cáo rằng chèn một khối agar chứa các chất điều
tiết sinh trƣởng thực vật khác nhau cho kết quả 100% thành công ghép chiết Eureka chanh trên Troyer Citrange. Apex tiền xử lý trên môi + 35% trung bình cộng 3% sucrose với GA3 ở 2,9 m mol / l; BA 44 mmol / lít và 2, 4-D ở 0,009 mola / lít.
Starrantino et al. (2003) báo cáo rằng kết quả tốt nhất ở cây có múi đã thu đƣợc khi cả hai thành phần ghép đã đƣợc xử lý trƣớc với 0,5 ppm BA, 0,5 ppm Kinetin hoặc 10 ppm 2, 4-D.
Năm 2003, trƣờng đại học Rajshahi ở Bangladesh đã thành công khi tiến hành tái sinh cây bƣởi từ mô sẹo và kết quả thu đƣợc khi nuôi cấy trên môi trƣờng MS có chất kích thích sinh trƣởng BAP với nồng độ 1 mg/l kết hợp với NAA 5 mg/l cho khả năng hình thành mô sẹo tốt nhất và các cây đạt 95% sống khi trồng ra đất. Bash et al. (2003) đã dùng kỹ thuật vi ghép kết hợp với xử lý nhiệt và hóa chất để tạo ra những cây citrus sạch bệnh. Kết quả đã tạo ra những cây citrus sạch bệnh mặc dù trƣớc đó họ đã dùng các đỉnh sinh trƣởng dƣơng tính với Citrus Tristeza Virus.
Naz et al. (2001) nghiên cứu khả năng áp dụng kỹ thuật micrografting cho
sự phát triển của cam quýt và báo cáo rằng thành công trong micrografting thay đổi theo phƣơng pháp và thực vật loài hoặc kiểu gen. Thành công ghép 34,7% đƣợc ghi lại với vết rạch đảo ngƣợc -T; Bề mặt đặt cho 26.7% thành công micrografts. Succari cam ngọt đáp ứng tối đa với phƣơng pháp đặt bề mặt trong khi đó, Kinnow mandarin cho thấy phản ứng tốt hơn với vết rạch T ngƣợc.
kỹ thuật vi ghép cần phải tiến hành qua 2 lần ghép. Sau vi ghép lần 1 khoảng 1,5 tháng cây đƣợc đƣa ra ngoài ống nghiệm. Đoạn trên cùng của cây đƣợc xem nhƣ là chồi. Chồi đƣợc ghép theo kiểu ghép cành bên vào cây gốc ghép sinh trƣởng khỏe và đƣợc buộc kín bằng giấy parafilm. Toàn bộ cây ghép đƣợc bọc trong túi nilon và giữ trong nhà kính. Túi nilon đƣợc tháo bỏ sau 3 - 4 tuần ghép. Sau ghép lần 2 chồi mới bắt đầu mọc lên từ đỉnh sinh trƣởng và sẵn sàng cho việc nhân giống. Trƣớc khi khai thác mắt ghép nhân giống (sau ghép lần hai 3 - 4 tháng), cây vi ghép đƣợc kiểm tra sự sạch vi khuẩn vàng lá và các virus khác.