Phần 2 Tổng quan tài liệu
2.5.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép
2.5. Khái niệm vi ghép
2.5.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến vi ghép
Độ lớn của mắt ghép và nồng độ Glucoza
Theo Hoc quellet (1999) nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trƣởng riêng đỉnh phân sinh thì hoàn toàn sạch virus. Tuy nhiên, việc phân lập đỉnh phân sinh có kích thƣớc 0,01-0,1 mm rất khó khăn và việc vi ghép thành công là rất thấp. Vì vậy ngƣời ta thƣờng tách đỉnh sinh trƣởng k m từ 2 – 3 lá bao, kích thƣớc từ 0,1- 1 mm qua đó tính sạch bệnh của mẫu vật nuôi cấy bị giảm xuống nhƣng khả năng ghép thành công đƣợc tăng lên và đó chính là phƣơng pháp đƣợc ứng dụng trong thực tiễn.
Chồi ghép có thể lấy trực tiếp hoặc nuôi cấy một thời gian ngắn trƣớc khi ghép.Tỷ lệ ghép thành công sẽ cao hơn khi nuôi lớn những đỉnh sinh trƣởng độc lập cho đến khi chúng có kích thƣớc lớn hơn trƣớc khi chúng đƣợc ghép (17,1). Khi thử với gốc ghép có độ tuổi thích hợp là 14 ngày, mắt ghép gồm 3 kích thƣớc tƣơng ứng với tỷ lệ thành công: 0,10 – 0,15 mm (2 mầm lá): 20% 0,20 – 0,30 mm (4 mầm lá): 30% 0,40 – 0,60 mm (6 mầm lá): 55% Nhƣ vậy, ghép mắt lớn dễ thành công nhƣng để đảm bảo tính sạch bệnh virus không nên dùng mắt ghép lớn hơn 0.5 mm.
Ở Ấn độ, năm 2012 một số nhà khoa học (Kumar Raj et al.) đã tiến hành sửa dụng phƣơng pháp vi ghép cải thiện giống Quýt Kinnow quýt (Citrus nobilis Lour × C. Deliciosa Tenora) bị nhiễm bệnh đốm vòng (ICRSV). Chồi quýt bị nhiễm bệnh có kích thƣớc khác nhau (0,2-1,0 mm) cắt ra từ cây ICRSV đƣợc vi
ghép trên cây gốc ghép bị chặt đầu của chanh nhám (C. jambhiri) và đã đạt đƣợc
thành công. Và họ đã đƣa ra kết luận rằng sự thành công của vi ghép phụ thộc vào 2 yếu tố nồng độ đƣờng sucrose và kích thƣớc của chồi ghép. Tăng kích thƣớc chồi 0,2-0,7 mm dẫn đến sự gia tăng tỷ lệ thành công vi ghép từ 30,55-
51,88%. Ngoài ra, sự thành công của vi ghép thu đƣợc với chồi 0,2 mm đã đƣợc cải thiện 30,55-38,88% bằng cách tăng nồng độ sucrose trong môi trƣờng nuôi cấy 5-7,5%. Các cây vi ghép đã đƣợc thử nghiệm cho ICRSV bằng phƣơng pháp phân tích ELISA và RT-PCR. Tất cả các cây lớn lên từ 0,2-mm cho kết quả âm tính với cả hai phƣơng pháp ELISA và RT-PCR. chỉ có 20% cây dƣơng tính khi sử dụng phƣơng pháp ELISA ở chồi có kích thƣớc 0,3-mm còn lại chồi đã đƣợc tìm thấy âm tính với ICRSV với RT-PCR.
Tuổi của gốc ghép
Theo Hà Thanh Thúy và cs. (2004) đã chứng minh rằng: Gốc ghép non, mắt ghép dễ bị mô sẹo hóa, khả năng nảy chồi thấp. Gốc già, mắt ghép khó liền, tỷ lệ mắt ghép nâu đen cao. Thích hợp nhất là từ 14 - 16 ngày tuổi của gốc ghép sau khi hạt nảy mầm. Kết quả cụ thể tính theo % ghép thành công là: 15,2; 16,6; 40,0; 37,1; 36,6; và 14,3% với tuổi gốc ghép tƣơng ứng là 10; 12; 14; 16; 18 và 20 ngày.
Navarro et al. (1975), trong thí nghiệm vi ghép đỉnh sinh trƣởng cây có múi đã sử dụng gốc ghép cao từ 4-5 cm, mất khoảng 14 -18 ngày để có một gốc ghép có chiều cao nhƣ vậy và họ phát hiện ra gốc ghép đƣợc đặt trong bóng tối cho tỷ lệ ghép thành công cao hơn. Tỷ lệ thành công họ đạt đƣợc là 30 – 50% và 95% cây vi ghép đƣa ra ngoài vƣờn có khả năng sống sót.
Tiến hành vi ghép Citrus reticulat trên 3 loại gốc ghép khác nhau Lahoty
et al. (2013), sử dụng chồi ghép từ 10 - 20 ngày tuổi. Kết quả tỷ lệ trung bình thành công cao nhất đối với 3 gốc ghép là 14 ngày tuổi đạt 32,22% trong khi gốc 10 ngày tuổi và 20 ngày tuổi tỷ lệ thành công là 0.00%.
Thí nghiệm với gốc ghép ở độ tuổi khác nhau 15, 21, và 60 ngày cho thấy gốc già, cứng nên khó cắt và dễ bị dập nơi vết cắt nhƣng ngƣợc lại do vỏ dầy cứng nên giữ đƣợc mắt ghép khi ta đặt vào, mắt ghép ít bị rơi khỏi nơi ghép và dễ liền sẹo sau khi ghép. Tuy nhiên chú ý phải nhẹ nhàng khi đặt mắt ghép vào tránh kẹp chặt làm tổn thƣơng cành ghép. Tuổi gốc ghép còn nhỏ thì nơi ghép dễ bị mô sẹo hoá và tốt nhất là gốc ghép ở độ tuổi 15 ngày sau nảy mầm.
Tính chất của ôi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng MSđƣợc coi nhƣ là một môi trƣờng cơ bản, đƣợc sử dụng phổ
biến trong nuôi cấy mô thực vật. MSO đƣợc phát minh bởi nhà khoa học thực vật Toshio Murashige and Skoog Folke K. vào năm 1962 trong quá trình tìm kiếm của Murashige cho cây trồng sinh trƣởng mới. Một số đằng sau các chữ cái MS
đƣợc sử dụng để chỉ ra nồng độ sucrose của môi trƣờng.Ví dụ MS0 không chứa sucrose và MS20 có chứa 20 g / l sucrose.Một loạt các thí nghiệm đã chứng minh rằng việc thay đổi nồng độ của các chất dinh dƣỡng tăng cƣờng sự tăng trƣởng đáng kể so với công thức MS hiện có. Ông xác định đƣợc rằng nitơ ảnh hƣởng quan trọng đến dự tăng trƣởng phát triển của cây. Từ đó các môi trƣờng phong phú khác xuất hiện dựa trên MS nhƣ: Môi trƣờng MS có bổ sung Vitamin, MS bổ sung Vitamin SH, MS bổ sung vitamin B5…
Sẽ có lợi hơn nếu các chồi ghép đƣợc đặt nuôi cấy trong môi trƣờng MS có chứa chất điều hòa sinh trƣởng. Laskar et al. (2008) đã chứng minh, thêm Cytokinin vào môi truờng nuôi cấy (0,1 mg Zeatin/l nếu chồi nuôi cấy trong 48 giờ; 0,01 mg Zeatin/l nếu nuôi thêm 48 - 240 giờ) có hiệu quả đặc biệt kích thích sự tiếp hợp nhanh chóng của gốc ghép và chồi ghép. Để mỗi lần ghép thành công, có một cách là nuôi chồi ghép trong môi trƣờng nuôi cấy có chất điều hòa sinh trƣởng trong một thời gian ngắn trƣớc khi ghép 5 - 10 phút trong môi trƣờng 10 mg/l 2,4 D hoặc 1 mg/l BAP làm tăng tỷ lệ thành công đối với cây có múi. Starratino and Caruso (2003), đạt tỷ lệ cây ghép sống khá cao khi nhúng chồi ghép và mặt cắt gốc ghép vào môi trƣờng có 0,5 mg/l BAP trong 20 phút truớc khi cả hai ghép lại với nhau.
Môi trƣờng đông đặc bằng agar và môi trƣờng lỏng đã đƣợc sử dụng cho nuôi cấy cây ghép. Rosely (2010) quan sát thấy rằng số lƣợng thành công micrografts tăng từ 10% trong môi trƣờng thạch rắn đến 60% trong táo và 70% trong quả lê sử dụng chất lỏng vừa phải. Thƣờng chất dinh dƣỡng và điều hòa sinh trƣởng của microshoots trong môi trƣờng lỏng linh động hơn, mà làm cho nó hiệu quả hơn so với môi trƣờng thạch cho vi ghép thành công. Môi trƣờng MS lỏng với vermiculite đã đƣợc tìm thấy tốt nhất cho sự phát triển hơn nữa của micrografts, vì môi trƣờng lỏng một mình hoặc với agar hình thức asphyxic điều kiện, trong đó ngăn chặn sự hình thành của rễ bên.
Kiểu ghép
Đặc tính di truyền và khả năng hấp thụ dinh dƣỡng của gốc ghép để nuôi chồi ghép, khả năng tiếp xúc của gốc ghép và chồi ghép để tạo hệ thống mạch dẫn vững chắc là điều kiện quyết định tỷ lệ sống của cây vi ghép. Mỗi cách ghép khác nhau cho khả năng tiếp xúc khác nhau của chồi ghép nên gốc ghép, vì vậy có thể nói rằng cách ghép có ảnh hƣởng đến tỷ lệ sống của cây vi ghép.
Navarro et al. (1975), vi ghép đỉnh sinh trƣởng của giống Temple tanger
lên gốc ghép là cây Troyer cistrange. Nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm những vị
trí ghép khác nhau và theo kết quả thì kiểu ghép chữ T ngƣợc cho kết quả tốt nhất cho sự phát triển của măt ghép, cũng nhƣ dễ dàng cho sự quan sát phát triển của mắt ghép.
Evandro (2011) vi ghép chồi đỉnh của các cây điều (Anacardium
occidentale L.) trồng trong nhà kính và trồng trong vƣờn lên gốc ghép là cây con
in vitro theo 2 phƣơng pháp: ghép bên và ghép trên đỉnh. Ông nhận thấy các phƣơng pháp ghép khác nhau có tác động đến tỉ lệ ghép thành công, phƣơng pháp ghép bên cho tỉ lệ thành công cao hơn.
Sự hóa nâu và khô dần của chồi ghép
Chồi khô dần là nguyên nhân dẫn đến sự thất bại của kỹ thuật. Để ngăn cản quá trình này, Holliday and Murashige (1972) đã dùng lớp vỏ mỏng môi trƣờng dinh dƣỡng có agar để liên kết nơi ghép.Agar sẽ làm tăng sự phát triển của chồi và chất dinh dƣỡng từ khối agar đƣơc tiết ra nuôi chồi trong suốt tuần thứ nhất đến tuần thứ ba sau khi ghép; nếu không sẽ có kết quả là cây ghép rất yếu. Chồi bị hóa nâu nguyên nhân do các chồi ghép quá nhỏ hay thao tác quá chậm, có thể hạn chế bằng cách ngâm chồi trong dung dịch chống oxy hóa 2g/l Sodium Diethyldithiocarabamate (DIECA) hoặc nhỏ một giọt dung dịch lên trên mặt cắt của gốc ghép ngay trƣớc khi ghép chồi lên. Theo Navarro (1988) thì thao tác nhanh kỹ thuật ghép nhanh sẽ ngăn cản quá trình oxy hóa phenol và có hiệu quả hơn những chất chống oxy hóa. Với 0,5 mg/l NAA đã làm tăng đáng kể tỷ lệ sống của tổ hợp ghép (37,5%) cao hơn rất nhiều so với môi trƣờng không có NAA (10,43%).
Hơn nữa khi có NAA thì không cần thƣờng xuyên khử chồi phụ so với khi không có NAA phải khử chồi phụ mỗi tuần hoặc 15 ngày một lần vì NAA ức chế sự hình thành và phát triển của các chồi phụ nhƣng kích thích gốc ghép mọc nhiều rễ phụ và phát triển rất tốt.
Khi kết hợp NAA và Kinetin với nồng độ trên, chồi ghép mau liền sẹo và phát triển tốt, sau 3 tuần kích thƣớc chồi đạt 8 mm. Tuy nhiên gốc có hiện tƣợng hình thành mô sẹo và không hình thành rễ cho dù ta cấy chuyền sang môi trƣờng không có chất điều hoà sinh trƣởng sau 2 tuần. Với 3 mg/l Adenin cây ghép có
tác dụng ngƣợc lại. Hiện tƣợng mắt ghép bị nâu đen hay bị khô đều thấy ở tất cả độ tuổi gốc ghép.
Kỹ thuật khử chồi phụ
Trong nách lá mầm của gốc ghép mắt ngủ, bình thƣờng thì bị ƣu thế ngọn ức chế. Khi ghép, chồi ngọn bị khử nên chúng phát sinh rất nhanh, gây ức chế phát triển của mắt ghép. Để tránh tình trạng này cần khử mắt chồi ngủ bằng cách khoét vào thân khi cắt bỏ hai lá mầm để loại chồi ngủ.
Chồi ngủ cũng có thể phát sinh từ tƣợng tầng của mặt cắt trên gốc ghép cần phải loại bỏ chúng ngay khi phát hiện để tạo điều kiện cho chồi ghép phát triển nhanh.
Sự tƣơng thích giữa chồi ghép và gốc ghép.
Khả năng mà 2 cây có thể ghép với nhau tạo thành một cây phát triển bình thƣờng gọi là tính tƣơng thích (trƣờng hợp ngƣợc lại gọi là tính không tƣơng thích). Khi cành ghép và gốc ghép có họ hàng gần với nhau thì có thể ghép với nhau dễ dàng và sẽ tăng trƣởng nhƣ là một cây. Ngƣợc lại, khi mắt ghép và gốc ghép không có họ hàng với nhau thì hầu nhƣ không thể kết nối với nhau thành công.
Các cây ghép không tƣơng hợp với nhau sẽ tạo nên những dị tật ở vết ghép. Các dị tật này có thể xác định dễ dàng thông qua một số triệu chứng bất thƣờng bên ngoài:
+ Không thể ghép thành công, hoặc chỉ thành công ở tỉ lệ rất thấp.
+ Hiện tƣợng chết sớm chồi chỉ sống đƣợc một thời gian ngắn sau khi ghép. + Tốc độ tăng trƣởng của mắt ghép và gốc ghép có sự khác biệt rõ ràng. + Có hiện tƣợng tăng trƣởng vƣợt mức ở phía trên, phía dƣới hoặc ngay tại vị trí ghép.
+ Gốc ghép và mắt ghép không kết nối với nhau tại vị trí ghép.
Một số trƣờng hợp, xuất hiện một vài triệu chứng trong số các triệu chứng trên, nhƣng không phải là do 2 cây không tƣơng hợp với nhau. Một số triệu chứng có thể xuất hiện do các điều kiện môi trƣờng không thích hợp, nhƣ thiếu nƣớc hoặc các chất dinh dƣỡng thiết yếu, do cây bị bệnh, bị côn trùng tấn công hoặc do phƣơng pháp ghép không tốt.
ghép với các gốc ghép sẽ có phản ứng tƣơng thích khác nhau với từng giống.Việc đánh giá gốc ghép cho sự thành công ghép cao hơn với một chồi riêng biệt chắc chắn sẽ giúp đỡ trong việc thƣơng mại hóa kĩ thuật vi ghép cho nhân giống hàng loạt giống cây trồng.