3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
- Hạt gieo trồng gốc ghép: Hạt quất, bƣởi.
- Chồi ghép từ 3 giống cam: cam Vân Du, cam Sunkit và cam V2.
- Các hóa chất nuôi cấy,dao ghép, tủ cấy và tủ tiệt trùng môi trƣờng và dụng cụ.
3.1.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
- Địa điểm: Khu nhà lƣới thí nghiệm của Bộ môn Di truyền và chọn giống cây trồng – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
+ Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thuộc Bộ môn Sinh lý Thực vật – Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Thời gian: từ 02/2017- 02/2018.
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Nghiên cứu về gốc ghép trong vi ghép
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu công thức khử trùng hạt bƣởi và quất làm gốc ghép.
Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của GA3 đến tỷ lệ hạt nảy mầm của các hạt
gốc ghép.
Nội dung 2: Nghiên cứu về chồi ghép trong vi ghép
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu phƣơng pháp khử trùng phù hợp đối với đoạn cành giâm 3 giống cam (Vân Du, Sunkit, V2) chuẩn bị chồi ghép.
Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ bật mầm của chồi ghép.
Nội dung 3: Nghiên cứu phương pháp vi ghép
Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của tuổi gốc ghép bƣởi đến tỷ lệ sống của vi ghép. Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của kích thƣớc đỉnh sinh trƣởng đến tỷ lệ sống của vi ghép.
Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của phƣơng pháp ghép đến tỷ lệ nảy mầm của mắt ghép.
Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép.
Nội dung 4: Giám định bệnh trên các mẫu cây vi ghép
Thí nghiệm 9: Kiểm tra tính sạch bệnh của cây sau vi ghép.
3.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
a. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm đƣợc thiết kế ngẫu nhiên hoàn toàn, mỗi công thức đƣợc bố trí 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 10 bình, mỗi bình chứa 5 cây.
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu công thức khử trùng các loại hạt bưởi, quất.
- Hạt bƣởi và quất đƣợc tách từ các quả chín, sạch bệnh và rửa sạch nhớt, phơi khô nơi thoáng gió, ánh sáng tán xạ. Trƣớc khi tiến hành thí nghiệm tiến hành ngâm hạt trong thuốc diệt nấm Cabenzin 0.2% trong khoảng từ 5-10 phút. Sau đó rửa kĩ lại bằng nƣớc cho đến khi sạch nhớt.
- Hạt đƣợc khử trùng bằng cồn 700 và các chất khử trùng khác theo các công thức nhƣ sau:
-CT1: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời gian 1phút -CT2: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 3 phút -CT3: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 5 phút -CT4: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 7 phút -CT5: Khử trùng hạt bằng cồn trong thời 9 phút -CT6: Khử trùng bằng Javen trong 15 phút -CT7: Khử trùng bằng Presept 5% trong 15 phút -CT8: Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút.
- Sau khi khử trùng theo các công thức trên, hạt đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Các thao tác đều đƣợc thực hiện trong buồng cấy.
- Tiến hành bóc vỏ hạt và cấy vào môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar. Tiến hành theo dõi tỷ lệ mẫu sạch, mẫu bị nhiễm sau 7 ngày cấy hạt để xác định công thức khử trùng tốt nhât.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của GA3 đến tỷ lệ nảy mầm của hạt gốc ghép
Do GA3 là chất điều hòa sinh trƣởng không bền với nhiệt nên đƣợc bổ sung theo các nồng độ vào môi trƣờng MS bằng màng lọc vô trùng Fitech có kích thƣớc lỗ lọc 0,2 µm. Hạt đƣợc khử trùng theo công thức tối ƣu từ thí nghiệm
1 đƣợc cấy vào các bình môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar và các nồng độ GA3 theo các công thức sau:
CT1: CT đối chứng, không sử dụng GA3 CT2: Sử dụng GA3 với nồng độ 20 mg/l CT3: Sử dụng GA3 với nồng độ 40 mg/l CT4: Sử dụng GA3 với nồng độ 60 mg/l CT5: Sử dụng GA3 với nồng độ 80 mg/l CT6: Sử dụng GA3 với nồng độ 100 mg/l.
Các bình sau khi cấy cho vào buồng tối 7 ngày rồi cho ra phòng sáng, nuôi trong điều kiện ánh sáng 16.000 lux, 16 giờ chiếu sáng, nhiệt độ phòng ổn định 250
C.
Tiến hành theo dõi và đếm tỷ lệ nảy mầm, sức nảy mầm của hạt theo các môi trƣờng thí nghiệm.
Thí nghiệm 3: Nghiên cứu phương pháp khử trùng phù hợp đối với đoạn cành giâm chuẩn bị chồi ghép.
- Mẫu cành đƣợc cắt từ các giống cam Vân Du, V2, Sunkit đã thu thập trồng trong nhà lƣới. Sau đó, các mẫu cành đƣợc rửa sạch bằng xà phòng và ngâm vào trong dung dịch thuốc diệt nấm Cabenzin 0,2% trong 10 phút, sau đó đƣợc rửa sạch bằng xà phòng dƣới vòi nƣớc chảy.
- Sau đó mẫu đƣợc cắt ngắn thành đoạn 5cm và đánh dấu mẫu giống rồi
đƣa vào buồng cấy khử trùng qua cồn 700 trong 3 phút. Tiến hành rửa sạch mẫu
bằng nƣớc cất 3 lần rồi tiếp tục xử lí bằng dung dịch diệt khuẩn sau. Mỗi công thức xử lý trong 10 phút:
CT1: Khử trùng cành giâm bằng Javen 5% CT2: Khử trùng cành giâm bằng Presept 5%
CT3: Khử trùng cành giâm bằng HgCl2 0,1%.
Sau đó tiến hành rửa các mẫu cành bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần rồi giâm cành vào môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar để trong phòng sáng (điều kiện ánh sáng 16.000 lux, 16 giờ chiếu sang), nhiệt độ phòng ổn định 250C.
Tiến hành theo dõi tỷ lệ mẫu sạch, mẫu bị nhiễm sau 7 ngày giâm cành để xác định công thức khử trùng tốt nhất.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ bật mầm của chồi ghép.
-Thí nghiệm trên 3 giống cam: Vân Du, Sunkit,V2 đƣợc khử trùng theo các phƣơng pháp ở thí nghiệm 3. Các mẫu cành đƣợc giâm vào môi trƣờng MS + 30g/l sucorose +6,5g/l agar với các công thức sau:
CT1: CT đối chứng CT2: MS+ 0,5 mg/l BAP CT3: MS+ 1 mg/l BAP CT4: MS+ 1,5 mg/l BAP CT5: MS+ 2 mg/l BAP CT6: MS+ 2,5 mg/l BAP
Các bình nuôi cấy để trong phòng sáng (điều kiện ánh sáng 16.000 lux, 16 giờ chiếu sang), nhiệt độ phòng ổn định 250C. Tiến hành theo dõi số ngày bật mầm đầu tiên, tỷ lệ bật mầm của cành giâm của các công thức thí nghiệm.
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của tuổi gốc ghép bưởi đến tỷ lệ sống của vi ghép
- Các gốc ghép đƣợc nuôi cấy từ hạt quất và bƣởi. Sau 1-4 tuần tuổi bật mầm, gốc ghép đƣợc tiến hành vi ghép với đỉnh sinh trƣởng của 3 giống cam: Cam Vân Du, cam Sunkit, cam V2. Mỗi công thức tiến hành trên 10 cây, lặp lại 3 lần.
CT1: Gốc ghép 2 tuần tuổi CT2: Gốc ghép 3 tuần tuổi CT3: Gốc ghép 4 tuần tuổi CT4: Gốc ghép 5 tuần tuổi
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của kích thước đỉnh sinh trưởng đến tỷ lệ sống của vi ghép.
- Đỉnh sinh trƣởng của 3 giống: Cam Vân Du, cam Sunkit, cam V2đƣợc cắt với kích thƣớc theo các công thức sau. Mỗi công thức tiến hành trên 10 cây, lặp lại 3 lần. Sau khi ghép tính tỷ lệ sống của các công thức đối với từng giống cam.
CT1: Đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc 1 mm CT2: Đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc 3 mm CT3: Đỉnh sinh trƣởng kích thƣớc 5 mm
Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của phương pháp ghép đến tỷ lệ nảy mầm của mắt ghép.
-Các thao tác đƣợc thực hiên dƣới điều kiện vô trùng.
-Dụng cụ ghép cần: kính lúp soi nổi, dao nhọn, nhíp, que cấy, đ n cồn, giấy vô trùng.
-Tiêu chuẩn của mầm ghép: Đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc nhỏ đƣợc tách từ các chồi mầm bật lên từ đoạn cành giâm vô trùng ở thí nghiệm 4.
-Tiêu chuẩn của gốc ghép: có tuổi thọ từ 14-20 ngày sau khi bật mầm, tốt nhất là 14-16 ngày.
- Chuẩn bị gốc ghép: Dùng dao cắt ngang thân gốc ghép cách nách lá khoảng 5- 7cm, cắt dứt khoát, vết cắt bằng, ngọt.
- Phƣơng pháp ghép: Tiến hành theo 3 phƣơng pháp: Cắt hình chữ T ngƣợc, kiểu nêm và hàm ếch, vết cắt đạt độ chính xác cao.
- Dùng panh đƣa mầm ghép vào khít vết bổ trên gốc ghép. Trƣớc khi ghép chà lên vết cắt gốc ghép một chút agar để hỗ trợ hiệu quả trong sự tiếp xúc giữa chồi ghép. Cắt ngắn lại bộ rễ chỉ để khoảng 3-4cm.
- Cấy chuyển môi trƣờng và nuôi cấy trong điểu kiên vô trùng. Tiến hành theo dõi hàng ngày để kiểm tra mắt ghép sống và tỷ lệ bật mầm.
-Thí nghiệm tiến hành trên 2 loại gốc ghép, gồm gốc quất và gốc bƣởi -Thí nghiệm vi ghép đỉnh sinh trƣởng trên cành cam của 3 giống: Cam Vân Du, cam Sunkit, cam V2
CT1: Ghép nêm CT2: Ghép chữ T CT3: Ghép hàm ếch
Thí nghiệm 8: Ảnh hưởng của môi trường đến tỷ lệ ra rễ của cây vi ghép.
- Cây sau vi ghép, bật chồi đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng MS + 6,5g agar/l + 30 g/l sucorose chứa nồng độ NAA khác nhau nhƣ công thức sau:
CT1: Đối chứng
CT2: MS + 0,5mg/l α-NAA. CT3: MS + 1 mg/l α-NAA
CT4: MS + 1,5mg/l α-NAA
Mỗi công thức tiến hành trên 5 cây. Theo dõi tỷ lệ ra rễ sau thời gian 1- 4 tuần.
Thí nghiệm 9. Giám định bệnh trên các mẫu cây vi ghép
Phƣơng pháp giám định theo Trung tâm nghiên cứu Bệnh cây- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
PCR dùng cặp mồi A2/J5 (Hocquellet et al., 1999) để phát hiện vi khuẩn
Candidatus Liberibacter asiaticus (Ca.Las).
Chiết DNA từ mẫu cây
DNA tổng số từ mẫu cam đƣợc chiết theo phƣơng pháp chiết nhanh
bằng NaOH (Wang et al., 1993). Toàn bộ gân chính của lá đƣợc nghiền trong
400 µL NaOH 0.5 M bằng chày và cối sứ sạch. Tiếp theo 5 µL của dịch nghiền đƣợc hòa trong 50 µL đệm Tris 0.1 M, pH8 và đƣợc sử dụng làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR.
Mồi PCR
Hai bộ mồi PCR đặc hiệu vi khuẩn Ca.Las đã đƣợc sử dụng là: A2 (TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT) và
J5 (ACAAAAGCAGAAATAGCA CGAACAA‟).
Cặp mồi này tạo sản phẩm 750 bp (Hocquellet et al., 1999)
Phản ứng PCR
Các phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong tube 0,2 µl với tổng thể tích là 15 µl, thành phần của mỗi phản ứng PCR nhƣ sau:
Thành phần Thể tích (µ )
H2O 6.4
GoTaq Green Master mix (2x) 7.5
Mồi xuôi dòng (20 µM) 0.3
Mồi ngƣợc dòng (20 µM) 0.3
DNA 0.5
+ Quy trình thực hiện phản ứng PCR 94oC 2 phút x 1 94oC 30 giây 54oC 30 giây x 35 72oC 1 phút 72oC 4 phút X 1 25oC 10 phút x 1
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel agarose 1 % đƣợc chuẩn bị bằng đệm TAE và chứa 0,5 mg/mL ethidium bromide.
b. Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu đánh giá gốc ghép và chồi ghép:
- Tỷ lệ nảy mầm của hạt, % = (Số hạt nảy mầm/ Tổng số hạt đem gieo)x 100.
- Tỷ lệ mẫu nhiễm, % = (Số mẫu bị nhiễm/ Tổng số mẫu đem cấy)x 100
- Ngày bật mầm đầu tiên của hạt, chồi: Đánh dấu ngày bật mầm đầu tiên
của hạt, chồi kể từ ngày nuôi cấy đối với từng công thức thí nghiệm.
- Số ngày bật mầm sau cấy: Tính từ khi cấy đến hạt, chồi đầu tiên nảy mầm
- Chiều dài, đƣờng kính của thân gốc ghép, thân chồi mới bật: Dùng thƣớc
panme đã tiệt trùng tiến hành đo cách gốc 0,5cm.
Các chỉ tiêu theo dõi sau vi ghép:
- Tỷ lệ mắt ghép sống(%) = (Số mắt ghép sống x 100)/ Tổng số mắt ghép.
- Tỉ lệ nảy mầm sau ghép(%)= (Số mắt ghép nảy mầm x 100)/Tổng số mắt
ghép sống.
Chồi mới đƣợc hình thành: là chồi mới bật lên từ chồi ghép ban đầu khi cây vi ghép còn sống.
+ Chiều cao, đƣờng kính chồi cây vi ghép (mm): Dùng thƣớc panme đã tiệt trùng tiến hành đo chiều cao, đƣờng kính của chồi cây vi ghép.
+ Tốc độ tăng trƣởng chiều cao: Tiến hành theo dõi 7 ngày/lần.
+ Số lá của chồi ghép: Số lá của chồi ghép là số lá có trên chồi ghép của
Tốc độ ra lá (lá/7 ngày): Tiến hành theo dõi 7 ngày/lần.
c. Phương pháp xử lý số liệu
PHẦN 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1. NGHIÊN CỨU CÔNG THỨC KHỬ TRÙNG CÁC LOẠI HẠT BƢỞI VÀ HẠT QUẤT BẰNG CÁC DUNG DỊCH KHỬ TRÙNG VÀ HẠT QUẤT BẰNG CÁC DUNG DỊCH KHỬ TRÙNG
Khử trùng mẫu cấy là việc làm khó vì mẫu sống không thể khử bằng nhiệt độ cao mà phải giữ đƣợc bản chất sinh học của nó. Để tăng tính linh động và khả
năng xâm nhập của chất diệt khuẩn, ngƣời ta xử lí mô nuôi cấy trong cồn 700.
Cồn là chất đƣợc dùng để khử trùng qua buồng cấy, tay, dụng cụ (kết hợp với nhiệt) có tác dụng tốt. Ngoài ra, cồn cũng đƣợc sử dụng để khử trùng bƣớc đầu các vật liệu cấy nhằm làm bất hoạt các bào tử nấm, vi khuẩn để dung dịch khử trùng sau có hiệu quả hơn.
Ngoài ra, trong thí nghiệm này cũng tiến hành khử trùng hạt theo quy trình nhƣ trên nhƣng thay cồn bằng dung dịch khử trùng khác nhƣ: Javen (Natri hyoclorit 5-6%), Presept 5%, HgCl2 0,1%.Đây là những dung dịch thƣờng dùng để xử lí mẫu sạch trong nuôi cấy invitro.
Qua quan sát sau 7 ngày gieo hạt cho thấy ảnh hƣởng của các dung dịch khử trùng trên đến tỷ lệ mẫu sạch nhƣ sau:
Bảng 4.1. Ảnh hƣởng công thức khử trùng đến tỉ ệ vô trùng của hạt quất
ĐVT: % Công thức khử trùng Tỉ ệ nhiễ (%) Tỉ ệ nảy ầ sau 4 tuần (%) Chất ƣợng cây CT1-Cồn 700 (1 phút) 100 0 0 CT2-Cồn 700 (3 phút) 100 0 0 CT3-Cồn 700 (5 phút) 85,2 24,2 Thân mảnh, lá xanh nhạt CT4-Cồn 700 (7 phút) 67,5 36,8 Thân mảnh, lá xanh nhạt CT5-Cồn 700 (9 phút) 21,4 21,6 Thân mảnh, lá xanh nhạt CT6- Javen (15 phút) 59,1 14,8 Thân mập, lá xanh đậm CT7- Presept 5% (15 phút) 46,4 24,1 Thân mập, lá xanh đậm CT8- HgCl2 0,1% (15
Với chất khử trùng à cồn 700
Cồn 700 là chất có tác dụng sát khuẩn và phá hủy thành cellulozo của tế
bào thực vật nên khi kéo dài thời gian khử trùng thì tỷ lệ sống của mẫu giảm đồng thời tỷ lệ nhiễm cũng giảm. Thời gian xử lí hạt quất trong cồn khác nhau cũng có ảnh hƣởng đến tỉ lệ mẫu sạch bệnh. Thời gian xử lí tăng từ 1 đến 9 phút sẽ làm tỉ lệ mẫu nhiễm cũng giảm xuống từ 100% (1 phút) xuống còn 21,4% (mức 9 phút). Trong các công thức so sánh chung nhận thấy xử lý cồn 7 phút cho kết quả mẫu nhiễm vẫn cao nhƣng tỷ lệ nảy mầm của hạt cao nhất là 36,8%.
Với các chất khử trùng khác
Có thể thấy xử lí hạt bằng dung dich HgCl2 0,1% cho tỷ lệ mẫu nhiễm ít
nhất, chỉ khoảng 25,8%, tiếp đó là Presept với 46,4%, còn dung dịch Javen cho tỉ lệ vô trùng trên 50%. Hạt đƣợc xử lí loại dung dịch khác nhau có tỷ lệ nảy mầm khác nhau, khử trùng bằng Presept cho tỷ lệ nảy mầm cao nhất với 24,1%, hơn nữa trong qua trình bóc vỏ hạt dễ tách bóc hơn các công thức còn lại, khử trùng bằng Javen tỉ lệ nảy mầm thấp nhất là 14,8%. Nhìn chung tỷ lệ hạt nảy mầm không cao (đều dƣới 30%).
Hình 4.1. Ảnh hƣởng công thức khử trùng đến sự nảy ầ hạt quất
Đối với hạt bƣởi cũng tiến hành thí nghiệm tƣơng tự. Kết quả thí nghiệm đƣợc biểu thị tại bảng 4.2.
Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của công thức khử trùng đến tỷ ệ vô trùng của hạt bƣởi ĐVT: % (số hạt xử lý mỗi CT: 30 hạt) Công thức khử trùng Tỉ ệ nhiễ (%) Tỉ ệ nảy ầ
sau 4 tuần (%) Màu sắc ầ bật
CT1- Cồn 700 (1 phút) 100 0 0
CT2- Cồn 700 (3 phút) 95 12,6 0
CT3- Cồn 700 (5 phút) 61,1 26,9 Thân thấp,nhỏ,lá xanh nhạt CT4- Cồn 700 (7 phút) 33,3 54,4 Thân mập,lá xanh đậm CT5- Cồn 700 (9 phút) 4,7 13,9 Thân thấp,nhỏ,lá xanh nhạt
CT6- Javen 66,7 25,9 Thân mập,lá xanh đậm
CT7- Presept 5% 66,7 35,1 Thân mập,lá xanh đậm CT8- HgCl2 0,1% 25,3 21,1 Thân thấp,nhỏ,lá xanh nhạt
Với chất khử trùng là cồn 700
Tƣơng tự nhƣ đối với hạt quất, thời gian xử lí hạt bƣởi trong cồn khác nhau cũng có ảnh hƣởng đến tỉ lệ mẫu sạch bệnh. Thời gian xử lí tăng từ 1 đến 9