VI. NHÂN GIỐNG INVITRO VÀ CÁC ĐẠC ĐIỂM KHÔNG DI TRUYỀN (EPIGENETIC)
7. Những tồn tại trong nghiên cứu đơn hộ
Mặc dù việc kích thích hạt phấn phát triển thành cây đơn bội là niềm hy vọng to lớn cho công tác cải lương giống cây trồng, Melchers (1977) đã đề nghị ứng dụng phương pháp này kết hợp với các phương pháp cổ điển khác, nuôi cấy bao phấn hiện nay vẫn chưa đáp ứng được yêu cầu to lớn của công tác giống cây trồng, vì kỹ thuật này mới thành công ở khoảng trên 30 loài của trên 20 chi. Điều nổi bật là thành công này mới chủ yếu ở các chi và loài thuộc họ cà (Solanaceae), họ cải (Brasicaceae) và hoà thảo (Graminaceae).
Thời gian qua người ta đã tiến hành các thí nghiệm với qui mô lớn trên đối tượng cây trồng ngũ cốc thuộc họ hoà thảo, nhưng kết quả mới hạn chế ở lúa mì (Piquard, 1978) và lúa nước (Niiseki và Oono, 1971, các tác giả Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam ...).
Muốn ứng dụng phương pháp đơn bội có hiệu quả đòi hỏi phải có số lượng đơn bội lớn. Nhưng đến nay có thể nói chúng ta chưa nắm được chính xác yêu cầu dinh dưỡng cần thiết.
Đối với thuốc lá, môi trường dinh dưỡng để nuôi bao phấn rất đơn giản gồm muối khoáng và đường saccharose, không cần các chất hữu cơ khác và hoóc môn sinh trưởng (Vasil và Nitsch, 1975).
Thế nhưng để nuôi cấy bao phấn lúa nước và lúa mỳ thành công, các tác giả Trung Quốc phải dùng thêm dịch chiết khoai tây mà thành phần chưa được biết tới. Mặc dù vậy bao phấn các loại ngũ cốc được nuôi cấy cũng chỉ tạo mô sẹo, để có cây hoàn chỉnh phải tiến hành tạo chồi từ mô sẹo đó. Thông thường thì tỷ lệ bạch tạng rất cao. Ví dụ Mix và ctv (1977) nhận được 3400 cây bạch tạng trong số 4000 cây yến mạch tái sinh từ mô sẹo bao phấn.
Ngoài ra trong số cá thể thu được thông qua bước tái sinh từ mô sẹo một tỷ lệ đáng kể đã là cây nhị bội (60%).
Trong nuôi cấy bao phấn, việc xuất hiện những phôi lưỡng bội từ tế bào lưỡng bội của vỏ bao phấn chưa thể loại trừ được. Vì vậy người ta đang thí nghiệm tạo cây đơn bội từ hạt phấn phân lập. Đương nhiên môi trường nuôi cấy hạt phấn phân lập đòi hỏi phức tạp hơn môi trường dinh dưỡng nuôi cấy bao phấn. Môi trường nuôi hạt phấn Petunia có chứa auxin, cytokinin và acid boric.
Thường là người ta phải nuôi cả bao phấn 4- 16 ngày trên một môi trường dinh dưỡng rồi sau đó mới tách riêng hạt phấn để nuôi tiếp tục trên môi trường cũ đó. Hiệu quả của phương pháp này rất cao, đã đạt tới 1000 phôi/đĩa petri. Thông qua quá trình nuôi trước đó môi trường dinh dưỡng được bổ sung thêm những chất cần thiết do bao phấn tiết ra. Glutamin là một thành phần quan trọng, nhưng còn nhiều chất khác vẫn chưa được biết tới.
Sau đây trình bày sơ lược qui trình tạo cây đơn bội thuốc lá từ hạt phấn phân lập (theo Nitsch, 1976).
a) Cảm ứng
+ Tạo cây đơn bội: Nụ hoa được xử lý bằng ly tâm 2000 vòng phút trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 5- 10oC, sau khi cắt để 48 giờ ở 2-5oC
+ Tạo cây nhị bội: Nụ hoa được ngâm trong dung dịch 0.04% colsicin và 2%
dimethyl sulfoxide (chất dẫn nạp) trong thời gian 24 giờ ở 2-5oC và hút chân không. Sau đó rửa sạch dung dịch colchicin và xử lý lạnh tiếp 24 giờ.