Cho tới nay việc sử dụng nhân giống invitro đã dược áp dụng cho rất nhiều loài cây (350 loài). Murashighe (1974) đã chia quy trình nhân giống thành 4 giai đoạn:
1. Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi.
2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro. 3. Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con.
4. Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên Hoa. lá, thân, củ, cuống lá, mô phân sinh.
Hình 7.3. Quy trình nhân giống invitro
1. Giai đoạn I – Cấy gây
Đưa mẫu vật từ bên ngoài vào nuôi cấy vô trùng phải đảm bảo những yêu cầu sau:
- Tỷ lệ sống cao.
- Tốc độ sinh trưởng nhanh.
Kết quả bước cấy gây này rất phụ thuộc vào cách lấy mẫu. Quan trọng nhất vẫn là đỉnh sinh trưởng, chồi nách, sau đó là hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh lá, rễ....
Ví dụ:
Măng tây chồi ngọn Kohler.1975.
Khoai tây mầm Morel.1952. Dứa chồi nách Paunethier. 1 976. Bắp cải mảnh lá Bimomillo.1975.
Xúp lơ hoa tự Kohler.1978.
Hoa Narcissus cuống hoa Seabrock.1976. Dưa (Cucurbita pepo) lá mầm Jelaska. 1 972. Geranium bao phấn Abo El-Nil. 1971 .
Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và môi trường
dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khoáng: Theo White (1943),
Heller (1953) hoặc
Murashige và Skoog (1962). Chất hữu cơ:
Đường saccharoza 1 - 6%
Vitamin: B1, B6, inositol, nicotinic acid.
Amino acid: Arg, Asp, Asp-NH2 Glu, Glu-NH2 Tyr. Hoóc môn: Auxin: IAA, IBA, NAA, 2,4-D.
Cytokinin: BAP, Kin, 2P. Gibberellin: GA3.
2. Giai đoạn II - Nhân nhanh
Ở giai đoạn này người ta mới kích thích tạo cơ quan phụ hoặc có cấu trúc khác mà từ đó cây hoàn chỉnh có thể phát sinh. Những khả năng tạo cây đó là:
- Phát triển chồi nách. - Tạo phôi vô tính.
- Tạo đỉnh sinh trưởng mới.
Trong giai đoạn này cần nghiên cứu các tác nhân kích thích phân hoá cơ quan, đặc biệt là chồi như:
- Bổ sung tổ hợp hoóc môn sinh trưởng mới (tăng kinetin giảm auxin).
- Tăng cường ánh sáng 16 giờ/ngày tối thiểu 1000lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng kích thích phân hoá mạnh (Weiss và Jaffe,1969).
- Bảo đảm chế độ nhiệt độ 20-300C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh nhất bằng môi trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích.
3. Giai đoạn III - Chuẩn bị và đưa ra ngoài đất
Đây là giai đoạn quan trọng bao gồm việc tạo rễ, huấn luyện thích nghi thay đổi nhiệt độ, độ ẩm, sự mất nước, sâu bệnh và chuyển từ trạng thái dị dưỡng sang tự dưỡng hoàn toàn.
Giai đoạn này thường bị bỏ qua một cách thiếu căn cứ.
Khi nghiên cứu về cấu trúc của lá cây khoai tây nuôi cấy invitro và so sánh với lá cây khoai tây trồng bên ngoài chúng tôi thấy chúng rất khác nhau. Cụ thể số lượng khí không cao hơn nhiều lần so với lá cây sống ngoài tự nhiên. Điều đó chứng tỏ phải tiến hành thích nghi dần dần cây nhân giống invitro với điều kiện tự nhiên. Quá trình thích nghi ở đây phải được hiểu là quá trình thay đổi những đặc điểm sinh lý và giải phẫu của bản thân cây non đó. Thời gian tối thì cho sự thích nghi là 2-3 tuần, trong thời gian này cây phải được chăm sóc và bảo vệ trước những yếu tố bất lợi sau:
- Mất nước nhanh làm cho cây bị héo khô.
- Nhiễm vi khuẩn và nấm gây nên hiện tượng bị thối nhũn. - Cháy lá do nắng.