CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phản ứng tổng hợp gắn PEG lên chitosan
3.1.3 Phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosan
Sau khi thực hiện xong phản ứng gắn PEG, chúng tôi tiến hành phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin như quy trình đã nêu ra ở chương 2. Kết quả của việc hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosan được phân tích qua phổ hồng ngoại (FTIR). Theo như hình 3.3, chúng tôi nhận thấy rằng có sự xuất hiện lại của hai phổ đặc trưng cho dao động nhóm chức amin của chitosan là 1560cm-1 và 1650cm-1. Đồng thời như đã nói ở trên, thì sau khi hủy bảo vệ chúng tôi vẫn thấy được sự tồn tại của hai đỉnh phổ đặc trưng cho nhóm chức của PEG là đỉnh phổ 1120cm-1 của dao động C=O và 2878cm-1 của dao động C-H.
Như vậy, quá trình gắn PEG lên chitosan mà chúng tôi thực hiện đã thành công.
3.2 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG
Sau quá trình chế tạo hạt chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG. Phương pháp tạo phức giữa các chất cao phân tử mang điện tích trái dấu để tạo thành các chitosan dạng hạt được ứng dụng nhiều do quy trình này khá đơn giản và dễ thực hiện. Hơn nữa, đây là phương pháp tạo liên kết ngang vật lý (physical cross-linking) hình thành do tương tác tĩnh điện giữa các điện tích trái dấu, thay vì tạo liên kết ngang hóa học, do đó tránh được độc tính mà các tác nhân hóa học gây ra. TPP là một polyanion, chất này có thể tương tác với cation chitosan bởi lực tương tác tính điện.
Quy trình tổng hợp hạt nano chitosan đã được trình bày trong chương 2. Để đánh giá sự tổng hợp hạt nano chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành phương pháp đo phổ hồng ngoại FTIR.
Luận Văn Thạc Sĩ 37 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến 3.2.1 Kết quả chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG qua phổ hồng ngoại FTIR
Thông qua việc phân tích phổ hồng ngoại FTIR, chúng tôi nhận thấy rằng ngoài các đỉnh phổ đặc trưng cho chitosan như 1560cm-1 và 1650cm-1 của dao động nhóm amin(- NH2), đỉnh phổ dao động đặc trưng của PEG như 2878cm-1 của dao động nhóm (C-H) và 1120cm-1 của dao động (C=O) thì còn có một đỉnh phổ khác xuất hiện là 1164cm-1 của nhóm P=O đặc trưng cho dao động của TPP. Tuy đỉnh phổ này khá ngắn nhưng cũng đủ để chúng tôi khẳng định được rằng có sự tạo liên kết ngang giữa ion chitosan với ion TPP.
Sau khi đo phổ hồng ngoại chứng tỏ được việc tạo thành liên kết ngang giữa chitosan gắn PEG với TPP. Hay nói cách khác đã có sự tạo thành hạt nano chitosan gắn PEG. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn chưa tìm ra tỉ lệ thích hợp giữa chitosan gắn PEG và TPP để tạo ra hạt nano được như mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện như sau:
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan gắn PEG
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ của chitosan gắn PEG đến kích thước hạt nano chitosan tạo thành. Ở đây, chúng tôi giữ nguyên nồng độ của TPP pha vào ban đầu, mà chỉ thay đổi nồng độ của chitosan gắn PEG theo khối lượng (w/w), phản ứng được thực hiện theo quy trình đã nêu ở chương 2 với nồng độ pH ổn định pha trước. Tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP được thay đổi như sau 1:1, 2:1 và 4:1. Sau khi thực hiện xong thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đo kích thước hạt bằng máy kích thước hạt(DLS) để xác định hạt nằm trong khoảng bao nhiêu.
Dựa vào hình kích thước hạt ở 3 tỉ lệ nêu trên, chúng tôi nhận thấy rằng ở tỉ lệ 1:1 thì kích thước hạt phân bố trong khoảng gần 100 nm. Trong khi đó đối với tỉ lệ 2:1 và 4:1 thì sự phân bố kích thước hạt đã có sự thay đổi, hạt phân bố theo kích thước lớn dần. Đổi với tỉ lệ 2:1 thì kích thước hạt phân bố trong khoảng từ dưới 100nm đến gần 6000nm. Đối với tỉ lệ 4:1 thì kích thước hạt đã tăng lên nhiều, hạt phân trong khoảng 1000-6000nm. Kích thước hạt lớn dần khi có sự thay đổi nồng độ của chitosan gắn PEG so với TPP theo tỉ lệ về khối lượng. Điều này có thể giải thích rằng, khi ta tăng nồng độ chitosan gắn PEG lên nhưng vẫn thay đổi lượng TPP như ban đầu, thì TPP sẽ không đủ để có thể tao liên kết ngang với chitosan gắn PEG nên hạt nano tạo ra có xu hướng tụ lại, làm cho kích thước hạt càng tăng lên.
Luận Văn Thạc Sĩ 39 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
Mặt khác, nhìn từ hình của 3 tỉ lệ đã khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng khi tỉ lệ của chitosan gắn PEG càng tăng thì màu của dung dịch pha được càng chuyển sang màu trắng đục. Điều này chứng tỏ rằng, kích thước hạt tăng lên khi có sự thay đổi tỉ lệ của chitosan.
Hình 3.6: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 2:1 (w/w)
Từ kết quả thu được sau khi đo DLS, chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo là 1:1.
3.2.3 Khảo sát độ ổn định của hạt nano chitosan
Sau khi tìm được tỉ lệ thích hợp để tiến hành các bước khảo sát tiếp theo. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự ổn định của hạt nano chitosan gắn PEG pha theo tỉ lệ 1:1 như đã phân tích ở trên.
Hình 3.8: Ảnh của các dung dịch pha theo tỉ lệ chitosan gắn PEG:TPP lần lượt là 1:1, 2:1, 4:1
Luận Văn Thạc Sĩ 41 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
Theo dõi sự thay đổi từ trực quan, chúng tôi nhận thấy rằng, màu sắc của mẫu pha theo tỉ lệ 1:1(w/w) hầu như không thay đổi theo thời gian.
Hình 3.9: Ảnh kích thước hạt của hạt nano chitosan gắn PEG theo thời gian theo bảng 3.1
Bảng 3.1: Kết quả sự ổn định của kích thước hạt theo thời gian
Thời gian 1 ngày 2 ngày 1 tuần 2 tuần 3 tuần 4 tuần
Kích thước hạt(nm) 107 107 105 106 106 108
(c) (d)
Sau khi đã tìm được tỉ lệ thích hợp và đã khảo sát độ ổn định của hạt theo thời gian, chúng tôi đã tiến hành chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin.
3.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin
Sau khi chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin theo quy trình đã cho ở chương 2, chúng tôi đem mẫu đi đo DLS và TEM. Kết quả thu được như hình 3.11 bên dưới:
Hình 3.10: Ảnh của mẫu pha theo tỉ lệ 1:1 (w/w) sau 4 tuần
Hình 3.11: Ảnh phổ DLS của hạt chitosan gắn PEG –TPP(a) và hạt chitosan gắn PEG bọc insulin(b)
Luận Văn Thạc Sĩ
Từ những kết quả thu nhận đ có kích thước tương đối tròn, thấy rằng sự phân bố kích th
giống nhau. Hạt chủ yếu phân bố ở khoảng 100nm, t nano không thay đổi kích th
100nm. Chúng tôi thấy rằng sự phân bố kích th không thay đổi bao nhiêu. Đi
lớn. Hơn nữa, theo ảnh DLS ở phân bố kích thước của hạt
này có thể là do khi bọc insulin, h
protein cũng khá cồng kềnh. Mặt khác, khi ch được đẹp khi chụp ảnh TEM. Điều n
mềm, nhạy. Nhưng khi bọc thu được rõ ràng hơn.
3.4 Xác định hiệu suất bao gói
3.4.1 Xác định hiệu suất bao gói bằng túi thẩm tách celluloseDung dịch sau khi lấy ra kh Dung dịch sau khi lấy ra kh
thấy rằng cường độ hấp thu tại b
năng xác định của đường chuẩn nồng độ. Do đó, để tăng tín hiệu đỉnh phổ tại b sóng 276nm, chúng tôi tăng n
Hình 3.12: Ảnh TEM của h PEG bọc insulin (b)
(a)
43 CBHD: PGS.TS Đ
ừ những kết quả thu nhận được, chúng tôi nhận xét rằng: hạt nano chitosan gắn PEG òn, đều. Dựa vào hình ảnh kích thước hạt chúng tôi nhận ấy rằng sự phân bố kích thước hạt khi chụp hình DLS và chụp TEM l
ạt chủ yếu phân bố ở khoảng 100nm, tương tự khi bọc insulin vào thì h ổi kích thước bao nhiêu, kích thước cũng chỉ phân bố khoảng tr
ấy rằng sự phân bố kích thước hạt trước hay sau khi ao nhiêu. Điều này chứng tỏ rằng lượng insulin được b
ữa, theo ảnh DLS ở hình 3.12a và 3.12b, chúng tôi thấy rằng độ rộng của sự ớc của hạt khi chưa bọc insulin là lớn hơn so với khi bọc
insulin, hạt có xu hướng tụ lại với nhau vì insulin là m ồng kềnh. Mặt khác, khi chưa bọc insulin thì hạt thu đ
ợc đẹp khi chụp ảnh TEM. Điều này là do hạt khi chưa bọc insulin là h ọc insulin, hạt lại có xu hướng bền, ít nhạy hơn nên h
ịnh hiệu suất bao gói và khả năng phóng thích ịnh hiệu suất bao gói bằng túi thẩm tách cellulose
hỏi túi thẩm tách sẽ được mang đi đo UV-Vis, k ờng độ hấp thu tại bước sóng 276nm rất yếu. Giá trị này n
ờng chuẩn nồng độ. Do đó, để tăng tín hiệu đỉnh phổ tại b sóng 276nm, chúng tôi tăng nồng độ Insulin trong mẫu. Một thể tích l
a hạt nano chitosao gắn PEG (a) và hạt chitosan gắn
(b)
CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
ợc, chúng tôi nhận xét rằng: hạt nano chitosan gắn PEG ớc hạt chúng tôi nhận ụp TEM là tương đối insulin vào thì hạt ớc cũng chỉ phân bố khoảng trên ớc hay sau khi bọc insulin là bọc không được ấy rằng độ rộng của sự ọc insulin. Điều ì insulin là một ạt thu được không insulin là hạt tương đối ơn nên hình ảnh
Vis, kết quả nhận ày nằm dưới khả ờng chuẩn nồng độ. Do đó, để tăng tín hiệu đỉnh phổ tại bước ẫu. Một thể tích là 0,02 ml dung
dịch insulin 5mg/ml được pha v 49.505 µg/ml) sau đó mang đi đo UV
Tại bước sóng 276nm dung dịch có c
đường chuẩn nồng độ Insulin, chúng tôi suy ra đ là 49.8343µg/ml (hình 3.14). 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0 10 20 đ ộ h ấ p t h ụ Hình 3.13: Phổ UV-Vis c hiệu chỉnh nồng độ
Hình 3.14: Đồ thị nội suy giá tr
ợc pha vào 2 ml dung dịch mẫu ( nồng độ insulin th 49.505 µg/ml) sau đó mang đi đo UV-Vis trong vùng từ 200nm đến 400nm.
ớc sóng 276nm dung dịch có cường độ hấp thụ 0.05, từ giá trị n
ờng chuẩn nồng độ Insulin, chúng tôi suy ra được giá trị nồng độ của dung dịch mẫu 14).
20 30 40 50 60 70 80
Cinsulin(µg/ml)
(49.8343; 0.050935)
Vis của dung dịch ngoài túi thẩm tách trước và sau khi
i suy giá trị nồng độ Insulin trong dung dịch mẫu sau khi
ịch mẫu ( nồng độ insulin thêm vào đạt ừ 200nm đến 400nm.
ờng độ hấp thụ 0.05, từ giá trị này và đồ thị ợc giá trị nồng độ của dung dịch mẫu
90
Luận Văn Thạc Sĩ 45 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
Theo như quy trình pha mẫu, nồng độ insulin thêm vào là 49.505mg/ml, nên nồng độ insulin ban đầu khi chưa hiệu chỉnh là 0.0147µg/ml. Tổng thể tích môi trường dùng kiểm tra hiệu suất bao gói là 40ml, nên suy ra khối lượng insulin tự do là 0.588mg. Hay nói cách khác là có 0.588mg insulin tự do không kết hợp với hạt nano trong 3ml dung dịch hạt nano thu được. Vậy trong 10ml dung dịch hạt nano có 1.96mg insulin tự do. Với khối lượng tổng insulin sự dụng là 2mg, thì hiệu suất bao gói (EE) sẽ được tính theo công thức như sau:
Từ công thức trên, chúng tôi tính được EE=15%. Như vậy, nếu so với các công trình bao gói chỉ có chitosan thì hiệu suất bao gói của chúng tôi còn thấp so với khi không gắn PEG vào chitosan. Nhưng điều đó không nói lên là chúng tôi đã không thành công, mà điều này khẳng định được rằng việc gắn PEG lên chitosan rồi bọc insulin sẽ đảm bảo cho việc tải thuốc được tốt hơn.
3.4.2 Khả năng phóng thích insulin
Kết quả khả năng phóng thích insulin của hạt chitosan gắn PEG được đo trong 1 ngày và được trình bày qua hình. Theo kết quả thu được cho thấy insulin được phóng thích từ từ phù hợp với yêu cầu của 1 hệ dẫn thuốc cần chế tạo.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 5 10 15 20 25 in su lin đ ư ợ c p h ó n g t h íc h ( % )
thời gian (giờ)
KẾT LUẬN VÀ HƯỚNG PHÁT TRIỂN
A .Kết luận
A1. Những công việc đã thực hiện
Trong đề tài, “ Nghiên cứu chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin ứng dụng trong điều trị bệnh tiểu đường’’, chúng tôi đã thực hiện được những công việc
sau đây:
- Tổng hợp phản ứng chitosan gắn PEG. Bao gồm 3 quá trình cụ thể như sau: Tiến hành phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosan
Phản ứng gắn PEG lên chitosan
Tiến hành phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin
Sau khi thực hiện xong phản ứng, các mẫu thí nghiệm sẽ được phân tích bằng phổ hồng ngoại (FTIR) để xác định cấu trúc của chất được tạo thành.
- Chế tạo nano chitosan gắn PEG bọc insulin. Trong phần chế tạo này bao gồm 2 quá trình:
Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG. Chitosan gắn PEG sẽ được hòa tan trong dung dịch axit acetic 2% và TPP. Các mẫu được thực hiện theo tỉ lệ giữa chitosan gắn PEG và TPP khác nhau.
Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin. Với tỉ lệ phù hợp giữa chitosan gắn PEG và TPP, chúng tôi tiến hành việc bọc insulin. Các kết quả của việc chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin sẽ được phân tích bằng DLS và TEM.
- Xác định hiệu suất bao thuốc bằng túi thẩm tách cellulose và khả năng phóng thích của thuốc theo thời gian.
A2.Những kết quả đã đạt được
Với những kết quả thu được cũng như thông qua các phương pháp phân tích như FTIR, DLS, TEM… chúng tôi có thể kết luận rằng chúng tôi đã chế tạo thành công hạt nano Chitosan gắn PEG và hạt nano Chitosan gắn PEG bọc Insulin bằng phương pháp tạo kết tủa-bay hơi dung môi. Đồng thời cũng xác định được hiệu suất bao thuốc và khả năng phóng thích của thuốc. Trong đó có một số kết quả như sau:
Luận Văn Thạc Sĩ 47 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến -Tổng hợp được chitosan gắn PEG
Sau khi tổng hợp được chitosan gắn PEG và kiểm tra mỗi bước làm bằng phương pháp phân tích phổ FTIR, các đỉnh phổ đặc trưng của PEG là 2878cm-1 và 1120cm-1 đã được nhìn thấy trên phổ FTIR của chitosan. Chúng tôi nhận thấy rằng có sự liên kết giữa chitosan và PEG ở sản phẩm cuối cùng trên đỉnh phổ FTIR. Từ đó giúp chúng tôi xác định được rằng việc gắn PEG lên chitosan đã được thực hiện thành công.
-Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bằng phương pháp kết tủa-bay hơi dung môi. Qua việc phân tích kết quả bằng TEM và DLS, chúng tôi đã kết luận được rằng việc đã chế tạo thành công hạt nano chitosan gắn PEG. Mặt khác, từ việc chế tạo này, chúng tôi cũng đã tìm ra được:
Thông số tỉ lệ khối lượng giữa chitosan gắn PEG và TPP lại ảnh hưởng tới kích thước của hạt nano. Tỉ lệ TPP càng thấp hạt càng có kích thước lớn, với tỉ lệ khối lượng chitosan gắn PEG:TPP đạt 4:1 thì hạt có kích thước rất lớn lên tới 6000nm. Để phù hợp với kích thước mà hạt nano cần đạt được khi chế tạo hạt thuốc thì chúng tôi đã tìm ra tỉ lệ thích hợp giữa chitosan gắn PEG:TPP là 1:1 với kích thước hạt nằm trong khoảng 100nm và hạt đã ổn định theo thời gian.
Theo ảnh TEM chúng tôi thu được cũng thấy hạt có hình dạng khá tròn. -Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin.
Qua kết quả phân tích ảnh TEM, chúng tôi thấy rằng độ rộng của sự phân bố kích thước của hạt khi chưa tải insulin là lớn hơn so với khi bọc insulin. Hạt lại có xu