Luận Văn Thạc Sĩ
Do mPEG có tính ưa nước n
vệ hạt nano chitosan bên trong, giúp tăng s phân hủy thuốc, từ đó làm tăng hi
1.5.5 Giới thiệu về chitosan gắCó nhiều cơ chế cho việc gắn Có nhiều cơ chế cho việc gắn của chitosan thông qua gốc biến đổi aldehyde tương tác v
mPEG-g-cts sau đó được kết tủa bằng ph
acid) hoặc tripolyphosphate trong dung dịch có d trong hạt.
1.6 Các phương pháp chế tạo nano chitosanHiện nay có nhiều phương pháp ch Hiện nay có nhiều phương pháp ch
nhiều nhất là tạo gel ion, ưu đi
và không cần phải sử dụng dung môi hữu pháp này được nghiên cứu rộng r
năng[15].
Hình 1.8: Một trong nh
15 CBHD: PGS.TS Đ
ớc nên sẽ hình thành lớp vỏ ngậm bên ngoài. T ên trong, giúp tăng sự ổn định của hạt thuốc, kéo d àm tăng hiệu quả chữa bệnh của thuốc[31].
ới thiệu về chitosan gắn mPEG
ế cho việc gắn mPEG lên chitosan trong đó có gắn lên nhóm alcohol ủa chitosan thông qua gốc -NCO. Ngoài ra còn có 1 cơ chế phổ biến khác l
ương tác với nhóm amine của chitosan theo cơ chế khử alkyl hóa. ợc kết tủa bằng phương pháp cross linking với poly
ặc tripolyphosphate trong dung dịch có dược chất do đó dược chất đ
ế tạo nano chitosan
ương pháp chế tạo nano chitosan. Phương pháp đư ưu điểm của phương pháp này là quá trình chu
ần phải sử dụng dung môi hữu cơ hay sử dụng lực nén lớn, do đó ph ứu rộng rãi trong tổng hợp chất dẫn thuốc và th
t trong những cơ chế gắn mPEG lên chitosan Hình 1.7: Cấu trúc mPEG
CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
ên ngoài. Từ đó giúp bảo ự ổn định của hạt thuốc, kéo dài thời gian
ên nhóm alcohol ế phổ biến khác là mPEG ế khử alkyl hóa. ới poly (glutamic ợc chất được bọc
ương pháp được sử dụng ình chuẩn bị đơn giản ử dụng lực nén lớn, do đó phương à thực phẩm chức
Những yếu tố ảnh hưởng đến tính chất hạt nano chitosan như kích thước hạt và sự tích điện bề mặt là khối lượng phân tử và độ deacetyl hóa của chitosan. Hiệu quả thu giữ thuốc của hạt nano chitosan phụ thuộc vào giá trị pKa và độ hòa tan của thuốc. Thuốc kết hợp với chitosan qua tương tác tĩnh điện, liên kết hidro,…… [15]. Sự lựa chọn phương pháp tổng hợp nano chitosan còn phụ thuộc vào bản chất của những phân tử hoạt động cũng như những yêu cầu dẫn truyền khác nhau[16]. Theo như S.A Agnihotri,et al (2004), có 5 phương pháp chủ yếu để tạo hạt nano chitosan: phương pháp khâu mạch nhũ tương (emulison cross-linking), phương pháp giọt tụ/kết tủa (coacervation/precipitation), phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương (emulsion- droplet coalesence), phương pháp tạo gel ion (ionic gelation) và phương pháp mixen đảo (reverse micellar)[28].
1.6.1 Phương pháp khâu mạch nhũ tương
Hỗn hợp nhũ tương nước trong dầu được tạo ra bằng cách phân tán dung dịch chitosan trong dầu. Những giọt lỏng được làm bền bởi chất hoạt động bề mặt. Dung dịch nhũ tương sau đó được khâu mạch bằng tác nhân tạo nối thích hợp như glutaraldehyde. Hai nhóm –CHO của glutaraldehyde sẽ phản ứng với nhóm –NH2 của chitosan để khâu mạch tạo hạt nano chitosan[28].
Luận Văn Thạc Sĩ 17 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến 1.6.2 Phương pháp giọt tụ/kết tủa
Phương pháp này sử dụng tính chất của chitosan là không tan trong dung dịch kiềm. Bởi vậy, chitosan sẽ bị kết tủa, tạo giọt ngay khi dung dịch chiosan tiếp xúc với dung dịch kiềm. Dung dịch kiềm có thể là NaOH, NaOH-metanol hoặc ethandiamine. Dung dịch chitosan sẽ được một thiết bị nén phun vào dung dịch kiềm để tạo hạt nano[28].
1.6.3 Phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương
Phương pháp này lần đầu được sử dụng vào năm 1999. Phương pháp này sử dụng nguyên tắc của cả hai phương pháp: tạo nối ngang nhũ tương và kết tủa. Thay vì sử dụng tác nhân tạo nối ngang, kết tủa tạo ra bằng cách cho giọt chitosan kết hợp với các giọt NaOH. Một hệ nhũ tương bền chứa dung dịch chitosan cùng với thuốc tạo ra trong paraffin lỏng. Đồng thời, một hệ nhũ tương bền khác chứa dung dịch chitosan và NaOH cũng được tạo ra theo cách như trên. Khi cả hai hệ nhũ tương này được trộn lại với tốc độ khuấy cao, các giọt từ mỗi hệ sẽ va chạm một cách ngẫu nhiên, hợp lại và kết tủa thành những hạt nhỏ[28].
1.6.4 Phương pháp tạo gel ion
Cơ chế của phương pháp này dựa trên tương tác tĩnh điện giữa chitosan tích điện dương và một polyanion như tripolyphosphate. Kỹ thuật này có ưu điểm là giai đoạn chuẩn bị đơn giản và thực hiện trong môi trường nước. Đầu tiên chitosan được hoàn tan vào dung dịch acid acetic. Sau đó chitosan được trộn lẫn với polyanion để tạo hạt nano chitosan dưới điều khiển khuấy từ liên tục tại nhiệt độ phòng. Kích thước và điện tích bề mặt có thể kiểm soát bằng cách sử dụng những tỷ lệ chitosan và polyanion khác nhau[28].
Hình 1.11: Sơ đồ chế tạo hạt bằng phương pháp hợp nhất giọt nhũ tương
Luận Văn Thạc Sĩ 19 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến 1.6.5 Phương pháp mixen đảo
Trong phương pháp này, người ta hòa tan chất hoạt động bề mặt vào dung môi hữu cơ để tạo ra những hạt mixen đảo. Dung dịch lỏng chứa chitosan và thuốc được thêm từ từ với tốc độ khuấy không đổi để tránh làm đục dung dịch. Pha lỏng được giữ sao cho hỗn hợp trở thành pha vi nhũ tương suốt. Sau đó tác nhân tạo nối ngang được thêm vào và khuấy qua đêm. Cô quay loại dung môi. Phần còn lại phân tán lại trong nước. Dung dịch muối thích hợp thêm vào để kết tủa chất hoạt động bề mặt. Hỗn hợp được ly tâm. Phần dung dịch ở trên chứa hạt nano mang thuốc được chiết ra, cho qua màng thẩm tách 1 giờ. Đông cô chất lỏng thu được cho ta bột thuốc[28].
1.7 Các thiết bị phân tích lý hóa[2] 1.7.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM 1.7.1 Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM
Kính hiển vi điện tử truyền qua- Transmission Electron Microscopy (TEM)- là một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano. Nó cho phép quan sát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0.2mm. Do đó, phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu nano. Nguyên tắc của phương pháp hiển vi điện tử truyền qua: trong phương pháp này, hình ảnh thu được chính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu. Công dụng chủ yếu của thiết bị này là để xác định một cách chính xác kích thước của hạt nano mà cụ thể đây là hạt chitosan gắn PEG. Dựa vào ảnh chụp các phần tử hạt bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích thước và hình dạng của hạt nano tạo thành.
1.7.2 Thiết bị đo phổ truyền qua UV-Vis
Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết cấu trúc, phân tích hỗn hợp xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích thước phân tử khi tiến hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ra một dạng phổ có chiều cao đỉnh phổ xác định và đặc trưng cho dạng hỗn hợp chất đó. Do vậy, khi đo phổ hấp thu của dung dịch insulin, ta sẽ thu được dạng phổ có đỉnh với chiều cao tương ứng với bước sóng khoảng 276 nm. Từ kết quả đó, ta xác định được sơ bộ rằng dung dịch ta thu được có chứa insulin với các chiều cao đỉnh phổ khác nhau tùy vào nồng độ insulin.
Hình 1.14: Máy TEM JEM 1010
Luận Văn Thạc Sĩ 21 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến 1.7.3 Máy đo phổ hồng ngoại(IR)
Các mẫu thí nghiệm trong luận văn được đo bằng máy Tensor TM 37 của hãng Burker tại phòng thí nghiệm Công nghệ Nano- ĐHQG TP.HCM.
Phổ hồng ngoại dùng để xác định cấu trúc phân tử của phân tử nghiên cứu dựa vào các tần số đặc trưng trên phổ đồ của các nhóm chức trong phân tử. Khi chiếu bức xạ hồng ngoại vào phân tử chất nghiên cứu, trong bản thân các phân tử luôn có trạng thái dao động phân tử.
Đối với phân tử hai nguyên tử chuyển động dao động duy nhất là chuyển động co dãn một cách tuần hoàn của liên kết giữa hai phân tử A-B. Loại dao động trên gọi là dao động hóa trị.
a) dao động hoá trị b) dao động biến dạng
Đối với những phân tử có số nguyên tử lớn hơn hai,trạng thái dao động của phân tử phức tạp hơn nhiều.Trong các phân tử này, ngoài các dao động hóa trị như phân tử hai nguyên tử, ta còn gặp các dao động biến hình (hay dao động biến dạng).
Hình 1.16: Máy đo phổ IR Tensor TM 37
Với phân tử có N nguyên tử có 3N-6 dao động chuẩn (phân tử thẳng hàng có 3N-5), mỗi dao động chuẩn ứng với một tần số dao động cơ bản.
Phương trình của sự hấp thụ bức xạ điện từ là phương trình Lambert-Beer: A=lg(1/T)=lg(I0/It)=ɛ.l.C
Trong đó:
A:mật độ quang; T-phần trăm ánh sáng truyền qua;I0-cường độ ánh sáng chiếu vào; It- cường độ ánh sáng truyền qua; ɛ-hệ số hấp thu phân tử; C- nồng độ(mol/l); l- chiều dài cuvet(m).
Từ các số liệu của dao động phổ, người ta có thể đi đến một số đặc trưng về cấu trúc phân tử. Dựa vào tần số (hoặc số sóng) đặc trưng của các nhóm chức người ta suy ra cấu trúc phân tử của chất cần nghiên cứu.
1.7.4 Máy phân tích kích thước hạt (particle size analysis)
Kích thước các hạt rắn trong dung dịch dung dịch được xác định bằng máy phân tích kích thước hạt LB 550 của hãng Horiba tại PTN Công Nghệ Nano.
Luận Văn Thạc Sĩ 23 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM
2.1 Hóa chất và dụng cụ- thiết bị 2.1.1 Hóa chất 2.1.1 Hóa chất
Tên hóa chất Công thức Nơi sản xuất
Chitosan(cts) (DD> 90%) Himedia
Phathalic anhydride(Ph.A) C8H4O3 Sigma
Axit clohidric HCl Merck- Germany
Natri hidroxit NaOH China
Dimethylformamide(DMF) C3H7NO Sigma
Sodium borohydride NaBH4 Merck- Germany
Methanol(MeOH) CH4O BASF-Germany
Triethylamine(Et3N) C6H15N Sigma
Dichloromethane(DCM) CH2Cl2 Sigma
p- Toluenesulfony chloride(TsCl) C7H7ClO2S Sigma
2-propanol C3H8O Merck- Germany
Tripolyphosphate(TPP) Na5P3O10 Sigma
Axit acetic CH3COOH Merck- Germany
Đệm Phophate Sigma
Methoxypolyethylene glycol amin(PEG) H2NCH2CH2(O CH2CH2)nOCH3
Sigma
Insulin Merck- Germany
Nước khử ion PTN Công Nghệ Nano
2.1.2 Dụng cụ
Thiết bị thí nghiệm chúng tôi sử dụng đã được trang bị tại Phòng Thí nghiệm Công nghệ Nano (LNT) - Đại Học Quốc Gia TP. HCM.
Để thực hiện các công đoạn chế tạo và đánh giá các sản phẩm chế tạo ra, trong luận văn này sử dụng các thiết bị và dụng cụ sau:
Tủ sấy với nhiệt độ tối đa là 250oC
Bếp khuấy từ có hệ thống ổn định nhiệt và tốc độ khuấy Cân phân tích trọng lượng tối đa 210 gam, thang cân 0.0001gr Bình khí nito
Máy đo kích thước hạt (DLS) Máy đo phổ hồng ngoại (FTIR)
Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Máy đo phổ hồng ngoại khả kiến (UV-Vis)
Các dụng cụ sử dụng làm thí nghiệm : pipet, lọ thủy tinh, giấy cân, muỗng cân, đĩa khuấy thủy tinh, cá từ, ...
2.2 Phương pháp
Trong luận văn này, chúng tôi thực hiện các thí nghiệm với 2 qui trình tổng hợp và chế tạo để có thể chế tạo được hạt chitosan gắn PEG bọc insulin.
2.2.2 Quy trình tổng hợp gắn PEG lên chitosan Quy trình này bao gồm 3 giai đoạn riêng biệt. Quy trình này bao gồm 3 giai đoạn riêng biệt.
2.2.2.1 Giai đoạn 1
Giai đoạn 1 là tiến hành phản ứng bảo vệ gốc amin (-NH2) của chitosan. Vì nhóm này trên chiosan rất dễ tham gia vào các quá trình phản ứng không mong muốn trong quá trình tổng hợp. Hơn nữa, quá trình chế tạo sau này, chúng tôi cần nhóm amin để tạo phản ứng với TPP trong việc tải insulin. Nên chúng tôi tiến hành phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosan.
Cho 3 gam chitosan vào 60ml dung dịch N,N-dimethylformamide (DMF.H2O 95,5%) chứa phthalic alhydrit (nPh.A= 3ncts). Đầu tiên, hỗn hợp sau khi đã chuẩn bị xong sẽ cho khí nito chạy qua để loại bỏ hoàn toàn không khí còn sót lại trong dung dịch phản ứng trong 20 phút. Tiếp theo hỗn hợp sẽ được khuấy và gia nhiệt ở 120oC trong điều kiện khí nito và được khuấy trong thời gian là 6 giờ. Sau 6 giờ, hỗn hợp được làm
Luận Văn Thạc Sĩ 25 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến nguội ở nhiệt độ phòng và được kết tủa trong nước đá. Các kết tủa được lọc bằng phểu lọc, rửa sạch với 150ml methanol (MeOH) ở nhiệt độ phòng, sấy khô chân không, thu được sản phẩm là bột màu trắng nhạt. Sản phẩm thu được sẽ được đem đi đo phổ hồng ngoại FTIR để xác định việc bảo vệ nhóm chức đã hoàn thành.
Phản ứng này được thể hiện rõ ràng hơn thông qua cơ chế phản ứng như sau:
2.2.2.2 Giai đoạn 2
Giai đoạn 2 là phản ứng gắn PEG lên chitosan.
Bản thân nhóm amin của PEG không thể tự trực tiếp tạo ra phản ứng với Pha-cts, nên p- Toluenesulfony chloride(TsCl) được sử dụng với mục đích hoạt hóa nhóm amin của mPEG.
Phản ứng này được thực hiện như sau: Đầu tiên chúng tôi chuẩn bị dung dịch bao gồm chitosan pha trong dung môi Dichloromethane (DCM) khuấy ở nhiệt độ 0oC. Sau đó, chúng tôi nhỏ giọt đồng thời một lượng dung dịch bao gồmTsCl, Triethylamine (Et3N) trong dung môi DCM vào dung dịch chitosan đã được chuẩn bị sẵn. Vì TsCl sau phản ứng cho sản phẩm phụ là HCl nên Et3N được sử dụng để tạo ra điều kiện trung hòa cho phản ứng. Điều kiện phản ứng xảy ra ở nhiệt độ 0oC, khuấy mạnh qua đêm. Sản phẩm được sau phản ứng sẽ được lọc qua nước đá lạnh, nhằm loại bỏ hết các chất chưa phản ứng và các chất dư thừa trong phản ứng.
Sau khi thực hiện xong phản ứng hoạt hóa nhóm (-OH), phản ứng gắn PEG lên Pha-cts đã đủ điều kiện để thực hiện. Cho một lượng PEG cố định hòa tan trong thể tích DMF để đạt được tỉ lệ 1:1(w/w) với chitosan, đã được thêm vào sản phẩm đã thu được ở
Hình 2.1: Sơ đồ phản ứng bảo vệ nhóm chức amin
Hình 2.2: Phản ứng bảo vệ gốc amin
Phathalic anhydride(Ph.A) + Chitosan Pha-cts
DMF+ H2O 120OC,N2 + DMF+ H2O (Ph.A) (Chitosan) (Pha-cts) 120oC, N2
phản ứng hoạt hóa nhóm (-OH). Phản ứng này được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm, khuấy đều, để qua đêm trong thời gian 5 ngày. Sau khi thực hiện xong phản ứng, sản phẩm được lọc diethyl ether để lọc hết các chất dư thừa. Sau khi thực hiện sấy khô chân không, sản phẩm thu được có dạng bột màu trắng, mịn.
Toàn bộ phản ứng gắn PEG lên Pha-cts được hiểu rõ hơn qua cơ chế phản ứng như sau:
2.2.2.3 Giai đoạn 3
Đây là giai đoạn thực hiện phản ứng hủy bảo vệ gốc amin của chitosan. Sau khi thực hiện xong phản ứng gắn PEG lên chitosan, chúng tôi tiến hành phản ứng hủy bảo vệ gốc amin của chitosan. Sau phản ứng này thành công, chúng tôi sẽ chuẩn bị tiến hành thực hiện phản ứng tạo hạt chitosan gắn PEG tải insulin.
Phản ứng hủy bảo vệ gốc amin được thực hiện như sau, cho một dung dịch chất bao gồm NaBH4, 2-propanol, nước DI được hoàn tan trong cts gắn PEG. Hỗn hợp sẽ được khuấy đều qua đêm, ở nhiệt độ phòng. Sau đó, axit acetic sẽ được thêm vào trong hỗn hợp và được tiếp tục khuấy trong 2 giờ, ở nhiệt độ 70oC. Sản phẩm được làm nguội ở nhiệt độ phòng. Sau đó sản phẩm sẽ được lọc rửa với nước DI và propanol để lọc bỏ các chất dư thừa trong phản ứng. Cuối cùng, chúng tôi đem sản phẩm đã được lọc rửa