Pha-cts + PEG
TsCl, Et3N
Cts-PEG( chưa hủy bảo vệ gốc amin
DCM,0oC
(Pha-cts)
(PEG)
Luận Văn Thạc Sĩ
Phản ứng hủy bảo vệ gốc amin sẽ đ
2.2.3 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG Trong phần chế tạo này, thí nghi Trong phần chế tạo này, thí nghi
hợp hạt nano chitosan gắn PEG có kích th hiện tổng hợp hạt chitosan gắn PEG
2.2.3.1 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG
Đầu tiên, chitosan gắn PEG đ
dịch chitosan được khuấy đều trong 30 phút để trong dung dịch acid acetic
trong 1ml dung dịch acid acetic có nồng độ pH t chitosan gắn PEG. Dung dịch TPP đ
Hình 2.5: sơ đồ phản ứng h
Hình 2.6: Phản ứng hủ
NaBH4
Cts-PEG ( chưa h
Khuấy gia nhiệ
27 CBHD: PGS.TS Đ
ản ứng hủy bảo vệ gốc amin sẽ được hiểu rõ hơn qua cơ chế phản ứng nh
ế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin
ày, thí nghiệm được chia làm hai giai đoạn. Giai đoạn 1 l ợp hạt nano chitosan gắn PEG có kích thước khoảng dưới 300nm. Giai đoạn 2 l ện tổng hợp hạt chitosan gắn PEG bọc insulin với kích thước đã được tổng hợp.
ế tạo hạt nano chitosan gắn PEG
ắn PEG được hòa tan trong 9ml dung dịch acid acetic
ợc khuấy đều trong 30 phút để chitosan gắn mPEG hòa tan hoàn toàn ịch acid acetic 2%. Sodium Tripolyphosphate (TPP) cũng đ
ịch acid acetic có nồng độ pH tương ứng với môi trường pH h ắn PEG. Dung dịch TPP đã được chuẩn bị trước sẽ được nhỏ giọt từ từ với
ng hủy bảo vệ phản ứng gốc amin của chitosan
ủy bảo vệ gốc amin
2-propanol
PEG ( chưa hủy bảo vệ gốc amin)
Khuấy qua đêm, to phòng
Axit acetic ệt, 80oC, 2h Cts-PEG NaBH4 EtOH,80oC CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến ế phản ứng như sau: ạn. Giai đoạn 1 là tổng ới 300nm. Giai đoạn 2 là thực
ợc tổng hợp.
ịch acid acetic 2%. Dung hòa tan hoàn toàn ũng được hòa tan ờng pH hòa tan ợc nhỏ giọt từ từ với
tốc độ khuấy từ mạnh vào dung dịch chitosan gắn PEG đã hòa tan trước đó, để đạt tỉ lệ khối lượng giữa chitosan gắn PEG:TPP là 1:1, 2:1, 4:1. Hệ được khuấy mạnh trong quá trình nhỏ giọt. Sau khi kết thúc nhỏ giọt, hệ vẫn được tiếp tục khuấy mạnh và ổn định trong thời gian là 2 giờ.
Hạt nano hình thành là kết quả của sự tương tác tĩnh điện giữa nhóm amino tích điện dương trên chitosan và nhóm tích điện âm trên tác nhân liên kết TPP. Dung dịch hạt nano chitosan gắn PEG thu được, chúng tôi mang đi ly tâm ở 20000 vòng/ phút trong 60 phút, thu phần hạt lắng đọng phía dưới ống ly tâm, rửa hạt nhiều lần bằng nước DI. Sản phẩm được tái huyền phù trong nước và để đông cứng bằng tủ đông qua đêm. Sản phẩm sau khi đông lạnh sẽ mang đi đông khô thu hạt trong thời gian là 3 giờ.
2.2.3.2 Chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc Insulin
Sau khi chế tạo thành công hạt nano chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành việc chế tạo hạt chitosan gắn PEG bọc insulin. Một lượng nano chitosan gắn PEG gồm 10mg sẽ được hòa tan trong 9ml dung dịch acid acetic với pH ổn định với nồng độ là 2%. Hệ được khuấy đều trong thời gian là 30 phút. Chúng tôi sử dụng 0,1 ml dung dịch có chứa 0,5 mg Insulin đã được chuẩn bị sẵn nhỏ giọt chậm vào dung dịch chitosan gắn PEG. Hỗn hợp được khuấy từ mạnh trong suốt quá trình nhỏ giọt trong khoảng 10
Luận Văn Thạc Sĩ
giữa chitosan gắn PEG và TPP là 1:1), hòa tan trong 1ml dung d Nhỏ từ từ dung dịch TPP đã chu
khuấy từ mạnh và ổn định trong su gian là 2 giờ.
Hai giai đoạn của qui trình ch
Hình 2.8: sơ đồ chế tạo hạt chitosan g
Hình 2.9: Phản ứng chdung d dung d
29 CBHD: PGS.TS Đ
n PEG và TPP là 1:1), hòa tan trong 1ml dung dịch acid acetic 2%. ã chuẩn bị xong vào dung dịch chitosan gắn PEG. H
nh trong suốt quá trình nhỏ giọt cho đến khi kết thúc trong
ình chế tạo nêu trên được tiến hành theo sơ đồ phản ứng sa
t chitosan gắn PEG bọc insulin
ng chế tạo hạt cts gắn PEG bọc insulin
+
Insulin
Axit acetic 2%
Nhỏ từ từTPP
Hạt cts dung dịch chitosan gắn PEG bọc insulin
CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến ch acid acetic 2%. n PEG. Hệ được t thúc trong thời ồ phản ứng sau: t cts-PEG bọc insulin
2.2.4 Hiệu suất bao thuốc
2.2.4.1 Dựng đường chuẩn nồng độ Insulin bằng UV-Vis
Cân 5mg Insulin hòa tan trong 10ml HCl 0,01 M để tạo dung dịch Insulin có nồng độ ban đầu là 500 µg/ml. Thực hiện dựng đường chuẩn với Insulin có nồng độ 0 đến 75 µg/ml theo bảng 2.2
Sau khi đã có được dung dịch insulin với nồng độ khác nhau như theo yêu cầu (bảng 2.2), mang chúng đi đo UV-Vis tại dải sóng ánh sáng từ 200nm tới 400nm, để
xác định cường độ hấp thu cực đại của insulin tại bước sóng ánh sáng 276 nm.
Kết quả đo UV-Vis tại các nồng độ của insulin 10, 20, 30, 40, 50, 75 µg/ml sau khi được cho như hình 2.10 dưới đây:
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6
Nồng độ insulin(µg/ml) 0 10 20 30 40 50 75
Insulin 500 µg/ml (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.5
HCl 0.01M (ml) 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9 8.5
Hình 2.10: Phổ hấp thu UV-Vis của Insulin tại các nồng độ 10, 20, 30, 40, 50, 75 µg/ml Bảng 2.2: Phương pháp xây dựng đường chuẩn
Bước sóng (nm) Độ
hấp thụ
Luận Văn Thạc Sĩ 31 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
2.2.4.2 Xác định hiệu suất bao gói của hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin bằng túi thẩm tách cellulose túi thẩm tách cellulose
Rút 3 ml dung dịch hạt nano chitosan gắn PEG bọc insulin vừa được chế tạo cho vào túi thẩm tách cellulose đã được xử lý (lượng còn lại đem đi đo DLS và TEM). Túi thẩm tách chứa 3 ml dung dịch hạt nano được nhúng vào trong một khay chứa 37 ml nước DI, khay có kích thước đủ để thể tích nước DI sử dụng nhấn chìm túi thẩm tách chứa hạt nano. Cho một cá từ nhỏ vào trong khay và thực hiện khuấy từ liên tục trong 4 giờ (việc sử dụng thời gian và thực hiện khuấy từ để đảm bảo sau khi trích mẫu nồng độ bên ngoài và nồng độ bên trong túi thẩm tách cân bằng nhau). Sau 4 giờ khuấy từ, trích 3 ml dung dịch môi trường ngoài túi thẩm tách đi đo UV-Vis để xác định thông số nồng độ insulin có trong môi trường, từ đó có thể suy ra nồng độ insulin tự do không kết hợp với hạt nano chitosan gắn PEG trong 10ml dung dịch đã chế tạo.
2.2.4.3 Khả năng phóng thích
Khả năng phóng thích insulin của hạt chitosan gắn PEG theo thời gian được thực hiện thông qua việc đo phổ hấp thụ UV-Vis. Các bước tiến hành như sau:
20mg hạt sau khi đông khô cho phân tán trong 20ml dung dịch đệm phosphate pH=7.4 sau đó cho vào túi thẩm tách và đặt trong 1 becher chứa 80ml dd đệm tương tự. 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 đ ộ h ấ p t h ụ Cinsulin(µg/ml)
Đặt becher vào bể điều nhiệt ở t=37ºC, khuấy nhẹ đến khi hỗn hợp đạt 37ºC (t=0), tiếp tục khuấy nhẹ trong suốt quá trình đo.
Ở t=0, t=5, t=10, t=20, t=30…(phút) hút khoảng 2-3ml dd trong becher ra cuvet đo, châm lại 2-3ml đệm pH vào lại để đảm bảo điều kiện tiến hành không đổi. Tiến hành đo UV-Vis ở 276nm, thêm chuẩn khi cần thiết.
Luận Văn Thạc Sĩ 33 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Theo các quy trình đã được trình bày nêu trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện các thí nghiệm và đã thu được kết quả khả quan.
3.1 Kết quả phản ứng tổng hợp gắn PEG lên chitosan
Theo các quy trình đã được trình bày ở chương 2, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm và thu được các kết quả như sau:
3.1.1 Phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosan
Kết quả thí nghiệm được đánh giá phổ FTIR. Phổ hồng ngoại của chitosan đã được DD hóa trước và sau khi thực hiện phản ứng bảo vệ nhóm chức amin được thể hiện ở hình 3.1. Kết quả cho thấy có nhiều sự khác biệt giữa các đỉnh phổ đặc trưng trong cả trước và sau khi thực hiện phản ứng. Phổ hồng ngoại của chitosan trước và sau khi phản ứng đều có vân hấp mạnh ở khoảng 2900cm-1 đặc trưng cho dao động liên kết của nhóm hydroxyl (-OH). Tuy nhiên, bên cạnh các phổ đặc trưng đó, chúng tôi nhận thấy phổ hồng ngoại trước và sau phản ứng đã có sự khác biệt rất rõ ràng. Đó là sau khi thực hiện phản ứng bảo vệ nhóm chức amin thì các vân hấp thụ ở 1650cm-1 và 1560cm-1 đặc trưng cho liên kết nhóm amin (-NH2) của chitosan đã không còn nhìn thấy. Mà thay vào đó là sự hiện diện của các đỉnh phổ 1782 cm-1 và 1710cm-1 đặc trưng cho dao động của nhóm C=O. Điều này cho thấy, sau khi thực hiện phản ứng bảo vệ nhóm chức amin, thì các đỉnh phổ đặc trưng cho nhóm (-NH2) đã bị che mất bởi các đỉnh phổ đặc trưng của dao động nhóm (C=O). Như vậy, có thể nói rằng, nhóm (-NH2) của chitosan ban đầu đã được bảo vệ thành công.
3.1.2 Phản ứng gắn PEG lên chitosan
Sau khi thực hiện xong phản ứng bảo vệ nhóm chức amin của chitosan. Chúng tôi tiến hành phản ứng gắn PEG lên chitosan. Kết quả của phản ứng được đánh giá qua phổ hồng ngoại FTIR. Dựa vào hình 3.2, chúng tôi nhận thấy rằng, ngoài các đỉnh phổ của chitosan sau khi thực hiện bảo vệ nhóm chức amin là 1782cm-1 và 1710cm-1 đặc trưng cho nhóm chức C-O, thì còn xuất hiện thêm các đỉnh phổ 1120cm-1 đặc trưng cho chức C=O, và đỉnh phổ 2878cm-1 đặc trưng cho nhóm chức C-H. Hai nhóm chức C=O và nhóm chức C-H ở các đỉnh phổ nêu trên đặc trưng cho PEG. Như vậy, từ phổ FTIR, chúng tôi có thể nói rằng,việc thực hiện phản ứng gắn PEG lên chitosan đã thành công.
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại (FTIR) của chitosan trước và sau khi bảo vệ nhóm chức amin
Luận Văn Thạc Sĩ 35 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
3.1.3 Phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosan
Sau khi thực hiện xong phản ứng gắn PEG, chúng tôi tiến hành phản ứng hủy bảo vệ nhóm chức amin như quy trình đã nêu ra ở chương 2. Kết quả của việc hủy bảo vệ nhóm chức amin của chitosan được phân tích qua phổ hồng ngoại (FTIR). Theo như hình 3.3, chúng tôi nhận thấy rằng có sự xuất hiện lại của hai phổ đặc trưng cho dao động nhóm chức amin của chitosan là 1560cm-1 và 1650cm-1. Đồng thời như đã nói ở trên, thì sau khi hủy bảo vệ chúng tôi vẫn thấy được sự tồn tại của hai đỉnh phổ đặc trưng cho nhóm chức của PEG là đỉnh phổ 1120cm-1 của dao động C=O và 2878cm-1 của dao động C-H.
Như vậy, quá trình gắn PEG lên chitosan mà chúng tôi thực hiện đã thành công.
3.2 Chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG
Sau quá trình chế tạo hạt chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG. Phương pháp tạo phức giữa các chất cao phân tử mang điện tích trái dấu để tạo thành các chitosan dạng hạt được ứng dụng nhiều do quy trình này khá đơn giản và dễ thực hiện. Hơn nữa, đây là phương pháp tạo liên kết ngang vật lý (physical cross-linking) hình thành do tương tác tĩnh điện giữa các điện tích trái dấu, thay vì tạo liên kết ngang hóa học, do đó tránh được độc tính mà các tác nhân hóa học gây ra. TPP là một polyanion, chất này có thể tương tác với cation chitosan bởi lực tương tác tính điện.
Quy trình tổng hợp hạt nano chitosan đã được trình bày trong chương 2. Để đánh giá sự tổng hợp hạt nano chitosan gắn PEG, chúng tôi tiến hành phương pháp đo phổ hồng ngoại FTIR.
Luận Văn Thạc Sĩ 37 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến 3.2.1 Kết quả chế tạo hạt nano chitosan gắn PEG qua phổ hồng ngoại FTIR
Thông qua việc phân tích phổ hồng ngoại FTIR, chúng tôi nhận thấy rằng ngoài các đỉnh phổ đặc trưng cho chitosan như 1560cm-1 và 1650cm-1 của dao động nhóm amin(- NH2), đỉnh phổ dao động đặc trưng của PEG như 2878cm-1 của dao động nhóm (C-H) và 1120cm-1 của dao động (C=O) thì còn có một đỉnh phổ khác xuất hiện là 1164cm-1 của nhóm P=O đặc trưng cho dao động của TPP. Tuy đỉnh phổ này khá ngắn nhưng cũng đủ để chúng tôi khẳng định được rằng có sự tạo liên kết ngang giữa ion chitosan với ion TPP.
Sau khi đo phổ hồng ngoại chứng tỏ được việc tạo thành liên kết ngang giữa chitosan gắn PEG với TPP. Hay nói cách khác đã có sự tạo thành hạt nano chitosan gắn PEG. Tuy nhiên, chúng tôi vẫn chưa tìm ra tỉ lệ thích hợp giữa chitosan gắn PEG và TPP để tạo ra hạt nano được như mong muốn. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện như sau:
3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chitosan gắn PEG
Chúng tôi tiến hành khảo sát nồng độ của chitosan gắn PEG đến kích thước hạt nano chitosan tạo thành. Ở đây, chúng tôi giữ nguyên nồng độ của TPP pha vào ban đầu, mà chỉ thay đổi nồng độ của chitosan gắn PEG theo khối lượng (w/w), phản ứng được thực hiện theo quy trình đã nêu ở chương 2 với nồng độ pH ổn định pha trước. Tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP được thay đổi như sau 1:1, 2:1 và 4:1. Sau khi thực hiện xong thí nghiệm, chúng tôi tiến hành đo kích thước hạt bằng máy kích thước hạt(DLS) để xác định hạt nằm trong khoảng bao nhiêu.
Dựa vào hình kích thước hạt ở 3 tỉ lệ nêu trên, chúng tôi nhận thấy rằng ở tỉ lệ 1:1 thì kích thước hạt phân bố trong khoảng gần 100 nm. Trong khi đó đối với tỉ lệ 2:1 và 4:1 thì sự phân bố kích thước hạt đã có sự thay đổi, hạt phân bố theo kích thước lớn dần. Đổi với tỉ lệ 2:1 thì kích thước hạt phân bố trong khoảng từ dưới 100nm đến gần 6000nm. Đối với tỉ lệ 4:1 thì kích thước hạt đã tăng lên nhiều, hạt phân trong khoảng 1000-6000nm. Kích thước hạt lớn dần khi có sự thay đổi nồng độ của chitosan gắn PEG so với TPP theo tỉ lệ về khối lượng. Điều này có thể giải thích rằng, khi ta tăng nồng độ chitosan gắn PEG lên nhưng vẫn thay đổi lượng TPP như ban đầu, thì TPP sẽ không đủ để có thể tao liên kết ngang với chitosan gắn PEG nên hạt nano tạo ra có xu hướng tụ lại, làm cho kích thước hạt càng tăng lên.
Luận Văn Thạc Sĩ 39 CBHD: PGS.TS Đặng Mậu Chiến
Mặt khác, nhìn từ hình của 3 tỉ lệ đã khảo sát, chúng tôi nhận thấy rằng khi tỉ lệ của chitosan gắn PEG càng tăng thì màu của dung dịch pha được càng chuyển sang màu trắng đục. Điều này chứng tỏ rằng, kích thước hạt tăng lên khi có sự thay đổi tỉ lệ của chitosan.
Hình 3.6: Sự phân bố kích thước hạt theo tỉ lệ chitosan gắn PEG: TPP là 2:1 (w/w)
Từ kết quả thu được sau khi đo DLS, chúng tôi nhận thấy rằng tỉ lệ phù hợp để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo là 1:1.
3.2.3 Khảo sát độ ổn định của hạt nano chitosan
Sau khi tìm được tỉ lệ thích hợp để tiến hành các bước khảo sát tiếp theo. Chúng tôi tiến hành khảo sát sự ổn định của hạt nano chitosan gắn PEG pha theo tỉ lệ 1:1 như đã phân tích ở trên.
Hình 3.8: Ảnh của các dung dịch pha theo tỉ lệ chitosan gắn PEG:TPP lần lượt là 1:1, 2:1, 4:1