Tinh bột tự nhiên Tinh bột sau biến tính (SDS) Thành phần (%) RS 65,82 ± 1,52a 11,29 ± 1.39b SDS 15,41 ± 2,03a 57,81 ± 1.21b RDS 18,77 ± 0,88a 30,91 ± 1.32b Tính chất vật lý Khả năng trương nở (%) 27,68 ± 1,14a 15,04 ± 0,45b Khả năng hòa tan (%) 12,50 ± 0,23c 46,15 ± 0,25d Khả năng hút nước (%) 81,99 ± 0,30a 136,44 ± 1,07b Khả nănghút dầu (%) 119,74 ± 0,34a 110,38 ± 0,10b Màu sắc L 83,09 ± 0,64a 80,89 ± 0,16b a* 2,27 ± 0,17a 2,85 ± 0,01b b* 13,48 ± 0,74a 14,34 ± 0,45a
Có thể thấy, phương pháp thủy phân tinh bột bằng enzyme pullulase kết hợp thoái hóa 2 lần đã mang lại hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm tăng từ 15,41% trong tinh bột khoai lang tự nhiên lên 57,81% sau biến tính. Kết quả này tương tự với nghiên cứu của Tian và cộng sự trên tinh bột gạo, phương pháp thoái hóa hai lần cho hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm tăng cao [120].
(2) Tính chất vật lý của tinh bột tiêu hóa chậm
Tinh bột sau khi biến tính được tiến hành phân tích khả năng trương nở và hòa tan. Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.13.
Nhận thấy, có sự thay đổi đáng kể trong tính chất của tinh bột tiêu hóa chậm so với tinh bột khoai lang tự nhiên. Khả năng trương nở của tinh bột giảm từ 27,68% xuống còn 15,04% sau khi trải qua quy trình biến tính. Nguyên nhân của sự giảm khả năng trương nở được cho là do sự gia tăng độ hoàn thiện của tinh thể và mức độ tương tác giữa các chuỗi amylose- amylose và amylose - amylopectin [248]. Kết quả tương tự đã được báo cáo bởi Huang và các cộng sự trên tinh bột khoai lang Trung Quốc [123]. Trong nghiên cứu về quy trình sản xuất SDS từ tinh bột khoai lang Trung Quốc, Huang và các cộng sự (2016) [123] đã có kết luận rằng khả năng trương nở của tinh bột sau biến tính giảm từ 21,1% xuống 9,97%.
Khả năng hòa tan của tinh bột tiêu hóa chậm là 46,15%, cao hơn nhiều so với tinh bột tự nhiên (12,50%). Sự tăng khả năng hòa tan này có thể do trong quá trình hồ hóa sự bay hơi nước trong huyền phù, dẫn đến hạn chế sức trương nở, làm giảm sự hấp thụ nước của các hạt tinh bột. Ngoài ra, thông qua quá trình biến tính các hạt
tinh bột dễ kết hợp với phân tử nước hơn, dẫn đến lượng amylopectin và amylose bị rửa trôi tăng, do đó, khả năng hòa tan của tinh bột tốt hơn [117].
Khả năng hút nước của tinh bột SDS đạt 136,44%, đồng nghĩa với việc cao hơn 54,45% so với mẫu tinh bột khoai lang ban đầu. Nguyên nhân được cho là do trên bề mặt của khối tinh bột SDS có các rãnh và lỗ nhỏ tạo điều kiện làm tăng khả năng xâm nhập của nước. So với tinh bột khoai lang tự nhiên, tinh bột SDS có khả năng hút dầu không chênh lệch quá nhiều. Khả năng hút dầu ở tinh bột SDS là 110,38% trong khi tinh bột ban đầu là 119,74%.
(3) Ảnh hưởng của quy trình sản xuất SDS tới màu sắc của tinh bột
Kết quả từ Bảng 3.13 cho thấy, quy trình sản xuất tinh bột tiêu hóa chậm không làm ảnh hưởng đáng kể tới màu sắc của tinh bột. Chỉ số L của tinh bột khoai lang tự nhiên là 83,09, lớn hơn không đáng kể so với mẫu tinh bột SDS (80,89). Chỉ số a* của tinh bột SDS đạt 2,85 lớn hơn so với kết quả 2,27 của mẫu tinh bột khoai lang tự nhiên. Cùng đó chỉ số b* của mẫu tinh bột SDS (14,34) cao hơn so với mẫu tự nhiên (13,48). Kết quả thu được thấy tinh bột SDS có màu sắc đậm hơn so với tinh bột khoai lang tự nhiên, tuy vậy sự khác biệt này không đáng kể.
(4) Ảnh hưởng của quy trình sản xuất SDS tới hình dạng của tinh bột
Nhận thấy, hạt tinh bột sau quá trình biến tính hướng tới tổng hợp SDS đã cho thấy sự biến đổi rõ ràng về hình dạng. Tinh bột khoai lang tự nhiên (Hình 3.10a và 3.10b) chủ yếu bao gồm các hạt hình cầu và hình đa giác với bề mặt hạt mịn và hầu như không có sự xuất hiện của vết nứt. Hình 3.10c và 3.10d là hình dạng của tinh bột đã qua biến tính bằng quy trình sản xuất SDS với bề mặt khối tinh bột sần sùi có nhiều rãnh nứt và lỗ nhỏ. Đây là kết quả của quá trình xử lý nhiệt làm các hạt tinh bột trương nở và hòa tan, phá vỡ cấu trúc hạt ban đầu, dẫn đến các chuỗi phân tử tinh bột liền kề bị biến dạng và kết tinh lại, từ đó hình thành cấu trúc giống như bọt biển sau quá trình thoái hóa [117]. Sự thoái hóa chủ yếu đến từ chuỗi amylose dẫn đến việc tổ chức lại cấu trúc tinh bột thành một phức hợp xoắn, làm tăng mật độ cấu trúc tinh thể và tăng đáng kể khả năng chống lại sự tấn công từ enzyme [249]. Đây cũng là nguyên nhân dẫn tới sự tăng lên của hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm.
Trong các nghiên cứu trước đây, kết quả tương tự đã được báo cáo trên một số loại tinh bột. Hu và cộng sự (2014) [117] đã quan sát thấy bề mặt mịn của hạt tinh bột lúa mì nếp tự nhiên với cấu trúc chặt chẽ và ít vết nứt, tuy nhiên, sau quá trình thoái hóa, cấu trúc hạt trở nên biến dạng và kết tụ lại thành tổ hợp với các vùng rỗng. Tinh bột gạo cũng được Tian và cộng sự (2013) [120] nghiên cứu cho thấy được sự thay đổi của bề mặt hạt tinh bột sau quá trình thoái hóa với sự xuất hiện của các lỗ nhỏ. Tổng kết quy trình và thông số tương ứng được thể hiện trong Hình 3.11.
Hình 3.11. Quy trình công nghệ thu nhận tinh bột tiêu hóa chậm từ tinh bột khoai lang
Dịch tinh bột nồng độ 10% (w/v, tính theo chất khô) được pha bằng đệm acetate 0,2M pH 5,0. Tiến hành đun cách thủy 30 phút để hỗn hợp được hồ hóa hoàn toàn, sau đó làm mát nhanh dưới vòi nước để đưa về nhiệt độ 55°C. Bổ sung enzyme pullulanase nồng độ 20 U/g vào tinh bột đã hồ hóa và duy trì điều kiện phản ứng trong 5 giờ. Khi phản ứng kết thúc, vô hoạt enzyme bằng cách đun sôi hỗn hợp trong 30 phút. Gel thu được sau quá trình thủy phân đem bảo quản ở nhiệt độ 4℃ trong thời gian 48 giờ để quá trình thoái hóa được diễn ra. Sau thoái hóa lần 1, các mẫu được đun sôi trong 30 phút, để nguội và thực hiện thoái hóa lần 2 ở cùng điều
kiện. Khi hoàn thành, đem hỗn hợp ly tâm với tốc độ 3660 rpm trong vòng10 phút, đổ bỏ dịch trong, tiếp đó bổ sung nước cất để rửa phần cặn thu được và lặp lại 2 lần. Kết tủa cuối cùng đem sấy ở 40oC trong khoảng 24 giờ để độ ẩm đạt nhỏ hơn 10%. Nghiền nhỏ và rây qua rây No120 để thu bột SDS thành phẩm.
Như vậy, quy trình tổng hợp SDS từ tinh bột khoai lang dưới tác dụng của enzyme pullulanase và phương pháp thoái hóa 2 lần đã mang lại hiệu suất tốt so với các nghiên cứu trước đây. Tính chất của tinh bột SDS thu được nổi bật với khả năng hòa tan và độ hút nước cao hơn đáng kể so vởi tinh bột tự nhiên. Bên cạnh đó, sản phẩm tinh bột biến tính SDS có màu sắc tối hơn so với màu sắc vốn có của tinh bột, tuy nhiên sự khác biệt không nhiều. Trong phần tiếp theo, kết quả nghiên cứu quy trình biến tính tinh bột khoai lang tạo đường chức năng isomaltooligosaccharide sẽ được trình bày.
3.3.Nghiên cứu điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide
Trong nghiên cứu, isomaltooligosaccharide được tổng hợp từ tinh bột khoai lang thông qua hai phương pháp: phân đoạn và đường hóa – gắn nhánh đồng thời. Ở mỗi phương pháp, các thông số công nghệ được điều tra và đánh giá mức độ ảnh hưởng đến hiệu quả tổng hợp IMO.
3.3.1. Điều kiện thu nhận isomaltooligosaccharide bằng phương pháp phân đoạn
Để tổng hợp isomaltooligosaccharide từ tinh bột khoai lang bằng enzyme transglucosidase với khả năng tạo liên kết α-1,6 glycosidic thì cần quá trình thủy phân trước đó đưa tinh bột từ thể rắn sang dịch lỏng với thành phần chính là oligosaccharide mạch ngắn như maltose và maltotriose. Đây là những cơ chất hoạt động tối ưu nhất của enzyme transglucosidase [146], [151]. Nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã thực hiện tạo hỗn hợp cơ chất oligosaccharide mạch ngắn cho transglucosidase bằng cách thực hiện 2 giai đoạn trước đó là dịch hóa và đường hóa tinh bột bằng enzyme [146], [154]. Trong nghiên cứu này, mức độ thủy phân (DE) và vai trò của thành phần oligosaccharide mạch ngắn được nghiên cứu kỹ lưỡng nhằm tìm ra tác động của chúng đến hiệu suất tạo thành IMO. Sau đó, nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố bao gồm nồng độ tinh bột, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, thời gian đến sự tạo thành các sản phẩm trong các giai đoạn dịch hóa, đường hóa và gắn nhánh nhằm đưa ra thông số cụ thể cho quá trình sản xuất IMO.
3.3.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hiệu quả tổng hợp isomaltooligosaccharide
Thành phần oligosaccharide trong sản phẩm của quá trình thủy phân tinh bột bằng enzyme là cơ chất được sử dụng bởi enzyme transglucosidase để tổng hợp IMO. Đương lượng dextrose DE (dextrose equivalent) biểu thị sự gia tăng của hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân và thể hiện cho mức độ thủy phân của dịch. Do đó, việc khảo sát ảnh hưởng của mức độ thủy phân (DE) dịch tinh bột trước khi bước vào giai đoạn gắn nhánh có ý nghĩa quan trọng. Để đánh giá ảnh hưởng của quá trình thủy phân (bao gồm dịch hóa và đường hóa) tinh bột trước khi đưa vào
có mức độ thủy phân (DE) khác nhau và thực hiện gắn nhánh các dung dịch đã chuẩn bị. Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và tính toán hàm lượng IMO234 là tổng của ba thành phần chính isomaltose (IMO2), isomaltotriose (IMO3) và isomaltotetraose (IMO4) trong hỗn hợp sản phẩm (Hình 3.12).
Hình 3.12. Ảnh hưởng của mức độ thủy phân đến hàm lượng IMO tạo thành
Kết quả đã chỉ ra mối tương quan thuận giữa hàm lượng IMO tổng và mức độ thủy phân của dịch đưa vào gắn nhánh. Khi DE tăng dần từ 12 đến 36, hàm lượng IMO234 thu được tăng dần từ 36,4 đến 52,3 g/l. Trong đó, với DE tăng từ 12 đến 20, kết quả thu được không có sự khác biệt có nghĩa (p < 0,05), lần lượt là 36,4 đến 38,3 g/l; khi tiếp tục tăng DE từ 26 đến 36, hàm lượng IMO thu được có xu hướng tăng nhanh hơn, từ 43,6 lên 52,3g/l. Có thể thấy, dịch có mức độ thủy phân cao thuận lợi hơn cho quá trình chuyển hóa tạo IMO, từ đó hàm lượng IMO thu được cao hơn so với dịch có mức độ thủy phân thấp trong cùng thời gian gắn nhánh. Điều này được giải thích rằng, enzyme transglucosidase vẫn có khả năng hoạt động trên dịch có mức độ thủy phân thấp nhưng kém hơn hẳn. Kết quả này phù hợp với một số nhận định đã được báo cáo trước đó. Theo Niu và cộng sự (2017) [151], việc tăng mức độ hóa lỏng của tinh bột (DE tăng từ 12 đến 30) đã rút ngắn thời gian transglycosyl hóa cần thiết để đạt được hiệu suất IMO cao nhất. Do đó, tinh bột có mức độ hóa lỏng cao tạo điều kiện tốt hơn cho sự hình thành IMO với hiệu suất tạo IMO trên thời gian phản ứng tăng.
Trên thực tế, hỗn hợp maltodextrins có thể hoạt động như cả chất cho và nhận glucosyl trong phản ứng chuyển hóa bởi transglucosidase. Tuy nhiên, enzyme transglucosidase có nguồn gốc từ Aspergillus niger được nhận định chỉ hoạt động tối ưu trên các oligosaccharide có mức độ trùng hợp thấp (DP) như maltose và maltotriose [7]. Như vậy, trước khi bước vào giai đoạn gắn nhánh, dịch tinh bột cần được tiến hành thủy phân để thu được nền cơ chất phù hợp nhất cho quá trình gắn nhánh bằng transglucosidase. Trong nghiên cứu này, dịch tinh bột khoai lang được
thủy phân thông qua giai đoạn dịch hóa bằng enzyme α-amylase và đường hóa bằng β-amylase kết hợp pullulanase.
3.3.1.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme α- amylase
(1) Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm α-amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa
Tiến hành nghiên cứu sự hoạt động của bốn chế phẩm enzyme alpha amylase Spezyme Xtra, Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS cho quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang. Các thí nghiệm được khảo sát ở cùng nồng độ cơ chất là 25% (tính theo khối lượng tinh bột khô), pH 5,8, nhiệt độ phản ứng là 80°C (Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS), 85°C (Spezyme Alpha và Termamyl SC DS) thời gian phản ứng 30 phút, nồng độ enzyme alpha amylase 1CU/g. Chi tiết về hàm lượng từng thành phần oligosaccharide trong thành phần thủy phân bằng các chế phẩm được thể hiện trên Hình 3.13.
Hình 3.13. Thành phần dịch sau thủy phân sử dụng các chế phẩm enzyme α-amylase
Phân tích Hình 3.13 cho thấy, hàm lượng G6 trong dịch thủy phân của Spezyme Xtra đạt tới 20,89 g/l so với Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha và Termamyl SC DS lần lượt chỉ đạt 18,07 g/l, 15,79 g/l và 17,02 g/l. Các thành phần G2, G3, G5 cũng cho kết quả tương tự. Tuy nhiên, với hàm lượng G4, chế phẩm Liquozyme SC DS cho kết quả cao hơn (5,06 g/l) so với các chế phẩm khác (3,38 - 4,41 g/l). Dựa vào kết quả chi tiết này, có thể nhận thấy rõ những đặc tính thủy phân khác nhau của từng chế phẩm.
Đánh giá sự hình thành đường glucose, oligossacharide và hàm lượng tinh bột sót sau phản ứng, kết quả được thể hiện ở Bảng 3.14.
maltodecaose (Ký hiệu: G2-G10) nằm trong khoảng từ 65,70% (Spezyme Alpha) đến 73,95% (Spezyme Xtra). Các chế phẩm Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha, Termamyl SC DS thủy phân cho hàm lượng G2-G10 tương đồng, và khác biệt với Spezyme Xtra. Hàm lượng oligosaccharide từ maltose đến maltohexaose (Ký hiệu: G2-G6) thay đổi từ 34,46% (Spezyme Alpha) đến 49,24% (Spezyme Xtra). Liquozyme SC DS và Termamyl SC DS cho kết quả tương đồng, khác biệt với Spezyme Alpha cũng như Spezyme Xtra (dựa theo phân tích thống kê). Hàm lượng glucose tự do tương đối thấp, chỉ từ 0,0% (Spezyme Xtra) đến 1,68% (Termamyl SC DS). Lượng tinh bột sót thấp nhất là 1,56% (Termamyl SC DS) và cao nhất đạt 2,15% (Liquozyme SC DS). Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS thủy phân cho lượng tinh bột sót tương đồng, Termamyl SC DS và Spezyme Alpha tương đồng và khác biệt so với hai chế phẩm còn lại.
Bảng 3.14. Thành phần dịch hóa tinh bột khoai lang sử dụng các chế phẩm enzyme α- amylase Chế phẩm enzyme G2-G10 (%w/w) G2-G6 (%w/w) Glucose (%w/w) Tinh bột sót (%w/w) Spezyme Xtra 73,95±0,02a 49,24±3,19a 0,00±0,00a 1,98±0,08a Liquozyme SC DS 68,02±0,81b 40,46±0,08c 0,61±0,86bc 2,15±0,05a Spezyme Alpha 65,26±0,30b 34,32±0,48b 0,51±0,72bc 1,64±0,01b Termamyl SC DS 67,53±2,91b 39,56±1,37c 1,68±0,03bc 1,56±0,08b
Ghi chú: Các giá trị trong cùng một cột có giá trị số mũ khác nhau thì khác nhau ở mức có nghĩa p < 0,05.
Từ những phân tích trên, Spezyme Xtra là chế phẩm cho khả năng thủy phân tạo thành G2-G10, G2-G6 cao nhất và glucose tự do là thấp nhất, đồng thời có sự khác biệt so với các chế phẩm còn lại. Hàm lượng tinh bột sót cũng tương đối thấp, cao hơn Termamyl SC DS và Spezyme Alpha. Tuy nhiên, nhiệt độ hoạt động của Spezyme Xtra là 80 ℃ thấp hơn đáng kể nhiệt độ hoạt động của hai chế phẩm trên là 85 ℃. Do vậy, sử dụng Spezyme Xtra mang lại lợi ích kinh tế hơn. Chọn chế phẩm cho quá trình dịch hóa là Spezyme Xtra.
Như vậy, lựa chọn được chế phẩm enzyme alpha amylase (Spezyme Xtra) sử dụng cho quá trình dịch hóa và thời gian dịch hóa trong quy trình sản xuất IMO từ tinh bột khoai lang bằng phương pháp thông thường (phân đoạn).
(2) Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Thay đổi nồng độ tinh bột trong khoảng 15% - 35% w/w trong điều kiện cố định các thông số còn lại: nhiệt độ 80°C, pH 5,0, nồng độ α-amylase 0,5 CU/g cơ chất và thời gian phản ứng 30 phút. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ đến quá trình dịch hóa sử dụng enzyme α- amylase được thể hiện trong Bảng 3.15.