Nồng độ enzyme β- amylase (U/g) DE 1,0 22,12 ± 0,77a 3,0 30,69 ± 0,67b 5,0 32,78 ± 1,01c 7,0 34,00 ± 0,41cd 9,0 34,67 ± 1,02d 11,0 35,15 ± 1,34d
Enzyme β- amylase thủy phân đặc hiệu các liên kết α-1,4 glycosidic từ đầu không khử trong phân tử maltodextrin tạo thành maltose [254], do đó số lượng gốc khử được giải phóng trong dung dịch tăng nhanh, làm DE tăng. Khi tăng nồng độ enzyme β-amylase từ 1,0 U/g đến 11 U/g, dịch thủy phân thu được có DE tăng đáng kể. Trong đó, giá trị DE tăng nhanh từ 22,12 lên 32,78 tương ứng với nồng độ từ 1 U/g lên 5 U/g. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme β-amylase lên 11 U/g, giá trị DE thu được chỉ tăng thêm 7% (từ 32,78 đến 35,15). Phân tích thống kê cho thấy, trường hợp nồng độ enzyme từ 1 U/g, 3 U/g và 5 U/g cho kết quả DE khác biệt có nghĩa. DE của dịch ở trường hợp nồng độ enzyme là 5 U/g có không có sự khác biệt với 7 U/g, kết quả DE từ 9 U/g, 11 U/g, 7 U/g là tương đồng. Vậy, lựa chọn nồng độ enzyme β- amylase 5 U/g cho giai đoạn đường hóa do nó mang lại hiệu quả hoạt động cao mà vẫn đảm bảo tính kinh tế.
(4) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa
Tiến hành thí nghiệm trên dịch thủy phân sau giai đoạn dịch hóa ở điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0, nồng độ enzyme β-amylase 5 U/g, thay đổi nồng độ enzyme pullulanase từ 0 đến 1,2 U/g và cố định thời gian đường hóa 3 giờ. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa được trình bày trong Bảng 3.21.
Từ kết quả nghiên cứu cho thấy, nồng độ enzyme pullulanase khác nhau được bổ sung vào dung dịch phản ứng đã cho thấy sự tác động đến đương lượng đường khử thu được sau thủy phân. Mẫu đối chứng không bổ sung pullulanase cho mức độ thủy phân đạt DE 27,45, tuy nhiên giá trị này đã đạt tối đa 34,92 khi bổ sung nồng độ 1,2 U/g enzyme pullulanase. Từ đó đã cho thấy vai trò của enzyme cắt nhánh trong giai đoạn đường hóa. Pullulanase có mặt trong dịch thủy phân đã tác động lên
sản phẩm tạo thành là các maltodextrin mạch thẳng có độ dài khác nhau, dẫn đến hàm lượng cơ chất có thể tham gia vào chuyển hóa maltose tăng [151].
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase đến quá trình đường hóa
Nồng độ enzyme pullulanase (U/g) DE 0 27,45 ± 0,42a 0,2 30,06 ± 0,18b 0,4 31,05 ± 0,96b 0,6 32,78 ± 1,01c 0,8 33,97 ± 0,62d 1,0 34,14 ± 0,41d 1,2 34,92 ± 0,80d
Khi nồng độ enzyme pullulanase bổ sung tăng từ 0,2 U/g lên 1,2 U/g, DE dịch thủy phân có xu hướng tăng dần từ 30,06 đến 34,92. Kết quả có xu hướng tăng rõ ràng hơn trong khoảng nồng độ 0,2 U/g đến 0,8 U/g, sau đó tiếp tục tăng nồng độ enzyme đến 1,0 U/g và 1,2 U/g thì kết quả thu được có sự tương đồng. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa nồng độ enzyme 0,8 U/g với các trường hợp sử dụng lượng enzyme thấp hơn (mức sai khác có nghĩa p < 0,05). Do đó, bổ sung nồng độ pullulanase 0,8 U/g kết hợp với enzyme β- amylase 5 U/g là điều kiện tối thích cho giai đoạn đường hóa thuộc quy trình sản xuất IMO từ tinh bột khoai lang.
(5) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình đường hóa bằng enzyme β- amylase và pullulanase
Để đánh giá tác động của thời gian thủy phân đến quá trình đường hóa, tiến hành thí nghiệm trong điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0, bổ sung enzyme β- amylase nồng độ 5 U/g và pullulanase 0,8 U/g, duy trì phản ứng và lấy mẫu tại một số mốc thời gian trong khoảng từ 1 giờ đến 24 giờ. Kết quả mức độ thủy phân của các mẫu được trình bày trong Bảng 3.22.
Bảng 3.22. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình đường hóa bằng enzyme β- amylase và pullulanase
Thời gian đường hóa (giờ) DE
1 23,94 ± 1,14b 2 30,26 ± 0,53c 3 33,97 ± 0,62d 6 35,68 ± 0,39e 12 36,88 ± 1,59e 24 36,91 ± 0,73e
Nhận thấy, khi thời gian đường hóa tăng dần từ 1 đến 24 giờ, DE thu được có sự thay đổi rõ ràng từ 23,94 đến 36,91. Trong thời gian từ 1 đến 6 giờ đầu của phản ứng, DE thể hiện xu hướng tăng nhanh (23,94 - 35,68). Tiếp tục kéo dài thời gian đường hóa lên 12 giờ và 24 giờ, giá trị DE thay đổi không đáng kể lần lượt là 36,88 và 36,91. Phân tích thống kê cho thấy, không có sự khác biệt có nghĩa giữa các kết quả thu được từ quá trình đường hóa với thời gian 6 giờ, 12 giờ và 24 giờ. Điều này được giải thích do sau thời gian đường hóa 6 giờ, thành phần các oligosaccharide trong hỗn hợp thu được bắt đầu có xu hướng thay đổi chậm, quá trình đường hóa gần như hoàn thành với maltose, maltotriose là sản phẩm chính và một số các sản phẩm phụ khác.
Hình 3.16: Ảnh hưởng của thời gian đường hóa thành phần oligosaccharide (G2: maltose, G3: maltotriose, G4: maltotetraose, G5-G10: tổng maltopentaose, (G2: maltose, G3: maltotriose, G4: maltotetraose, G5-G10: tổng maltopentaose,
maltoheptaose, maltooctaose, maltononaose và maltodecaose)
Tương tự giá trị DE, trong thời gian từ 0 đến 6 giờ đường hóa, hàm lượng maltose (G2) tạo thành tăng đáng kể từ 5,13% đến 50,31%. Tiếp tục duy trì phản ứng, nồng độ maltose thay đổi rất chậm, lần lượt tăng 4,03% sau 12 giờ (54,34%) (Hình 3.16). Maltotriose là sản phẩm quan trọng thứ hai sau maltose. Hàm lượng maltotriose cũng tăng dần theo thời gian đường hóa, từ 10,30% trong hỗn hợp sau dịch hóa tăng lên 20,20% sau đường hóa 12 giờ. Đặc biệt, phần lớn sự biến đổi chỉ diễn ra trong 6 giờ đầu đường hóa, thời gian sau đó hàm lượng oiligosaccharide này tương đối ổn định. Có thể thấy, hàm lượng G2 và G3 tăng là kết quả quá trình tác động của β-amylase và pullulanase lên các phân tử maltooligosaccharide có mạch dài hơn, do đó, hàm lượng các thành phần này sẽ giảm dần trong quá trình phản ứng. Cụ thể, sự tạo thành maltotetraose (G4) chỉ tăng trong 1 giờ đầu đường hóa (từ 3,86% lên 12,94%), sau đó giảm dần về xấp xỉ bằng 0 sau 6 giờ phản ứng. Tương tự, G5-10 giảm mạnh từ 39,07% về 3,28% sau 12 giờ. Trong nghiên cứu đã được báo cáo bởi Lin và cộng sự năm 2013 [255], xu hướng biến đổi các oligosaccharide trong giai đoạn đường hóa với β-amylase và pullulanase từ tinh bột ngô và gạo hoàn toàn tương đồng với kết quả này. Như vậy, tùy thuộc vào thời gian đường hóa,
0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 Thà nh ph ần o lig os ac cha ride (%)
Thời gian (giờ)
thành phần có sự thay đổi mạnh nhất là maltose và maltotriose, tăng từ 12,39% lên 75,10% sau 12 giờ.
Thành phần maltose, maltotriose và các oligosaccharide khác tạo thành từ quá trình dịch hóa và đường hóa là cơ chất cho sự chuyển hóa tạo isomaltooligosaccharide với transglucosidase, do đó, chúng có tác động trực tiếp đến hàm lượng IMO tạo thành. Hình 3.17 thể hiện tổng hàm lượng IMO2, IMO3, IMO4 (IMO234) và thành phần cụ thể tạo thành từ dịch thủy phân có các khoảng thời gian đường hóa khác nhau.
Hình 3.17. Ảnh hưởng của thời gian đường hóa đến quá trình gắn nhánh tạo IMO
Nhận thấy, khi dịch thủy phân có thời gian đường hóa càng kéo dài thì hàm lượng IMO234 thu được ở giai đoạn gắn nhánh càng tăng lên. Trong đó, với thời gian đường hóa tăng từ 1 giờ đến 6 giờ hàm lượng IMO trong dịch sau gắn nhánh có xu hướng tăng mạnh (40,66 g/l đến 53,38 g/l). Tiếp tục kéo dài thời gian đường hóa đến 12 giờ và 24 giờ thì hàm lượng IMO thu được tăng chậm lên 55,12 g/l. Trong đó, isomaltose (IMO2) chiếm phần lớn trong hỗn hợp sản phẩm (trên 60%), sau đó là isomaltotriose (IMO3) và cuối cùng là isomaltotetraose (IMO4). Kết quả này được giải thích bởi cơ chế tác động của transglucosidase, enzyme thủy phân từ đầu không khử và tạo liên kết α- 1,6 glycosidic với các cơ chất nền có trong dung dịch, do đó, IMO2 là sản phẩm hình thành đầu tiên trong ba hợp chất được quan tâm, theo sau đó là IMO3 và IMO4. Kết quả trên đã chỉ ra vai trò tăng cường sự hình thành IMO của enzyme β-amylase và pullulanse thông qua việc tăng hàm lượng của maltose, maltotriose và các maltooligosaccharide khác, do đó thúc đẩy quá trình chuyển hóa đường bằng transglucosidase [151]. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa của hàm lượng IMO tạo thành từ mẫu đường hóa 6 giờ so với các khoảng thời gian trước đó, mẫu đường hóa 24 giờ cho kết quả lớn nhất. Tuy nhiên, việc tăng tăng thời gian đường hóa gấp 4 lần với hiệu suất IMO tăng 1,74 g/l không đảm bảo giá trị kinh tế. Do đó, nhóm nghiên cứu lựa chọn kết thúc đường hóa sau 6 giờ và đưa hỗn hợp vào giai đoạn gắn nhánh.
Tóm lại, quá trình đường hóa trong quy trình chuyển hóa tạo IMO được thực hiện bằng enzyme β-amylase nồng độ 5,0 U/g và enzyme pullulanase nồng độ 0,8 U/g ở điều kiện nhiệt độ 50°C, pH 6,0 và duy trì phản ứng trong thời gian 6 giờ. Kết thúc giai đoạn đường hóa, DE dung dịch đạt 35,68. Vô hoạt enzyme bằng cách đun sôi hỗn hợp trong vòng 10 phút và chuẩn bị cho giai đoạn gắn nhánh tiếp theo.
3.3.1.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến hàm lượng
isomaltooligosaccharide tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
(1) Ảnh hưởng pH đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
Tác động của pH môi trường gắn nhánh lên hiệu quả hoạt động của enzyme transglucosidase thể hiện trực tiếp qua hàm lượng IMO tạo thành. Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng pH trong giai đoạn gắn nhánh được tiến hành với pH phản ứng thay đổi từ 4,0 đến 6,0 trong điều kiện cố định nhiệt độ tại 60°C, nồng độ enyzme transglucosidase 10 U/g và duy trì thời gian phản ứng trong 12 giờ. Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và kết quả được tóm tắt trong đồ thị Hình 3.18.
Hình 3.18. Ảnh hưởng pH gắn nhánh đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, hàm lượng IMO tạo thành phụ thuộc rõ rệt vào pH của phản ứng gắn nhánh. Hàm lượng IMO tổng đạt được giá trị cao nhất 50,03 g/l tại điều kiện pH 5,0 và thấp nhất là 37,83 g/l tại pH 4,0. Thành phần IMO2,IMO3 và IMO4 tăng dần khi thay đổi pH từ 4,0 đến 5,0 và giảm dần trong khoảng pH 5,0 – 6,0. Trong đó, IMO2 chiếm phần lớn (62,1% tại pH 5,0), sau đó là IMO3 (25,9% tại pH 5,0) và chiếm phần trăm nhỏ nhất là IMO4 (12,0% tại pH 5,0). Phân tích thống kê cho thấy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhà sản xuất Megazyme, transglucosidase hoạt động tối ưu tại pH 4,5 và ổn định tại pH 4,0 – 6,0, gần với điều kiện được chỉ ra trong nghiên cứu này là pH 5,0. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của Basu và cộng sự, pH 5,0 là môi trường thích hợp cho enzyme transglucosidase (thu nhận từ Aspergillus niger) gắn nhánh khi sản xuất IMO từ tinh bột [147]. Điều kiện pH tương tự đã được Cui và cộng sự áp dụng trong nghiên cứu tạo IMO từ bột hạt dẻ [154]. Niu và cộng sự [151] cũng chứng minh hoạt độ cao nhất của transglucosidase đạt được trong khoảng pH = 5,0 - 5,5. Như vậy, điều kiện pH 5,0 tạo điều kiện hoạt động tốt nhất cho enzyme transglucosidase và hoàn toàn phù hợp với các kết quả được báo cáo trước đây. Lựa chọn pH phản ứng của giai đoạn gắn nhánh được lựa chọn là pH 5,0.
(2) Ảnh hưởng nhiệt độ đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
Để đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ lên hàm lượng IMO tạo thành, tiến hành thí nghiệm trong điều kiện thay đổi nhiệt độ từ 50°C đến 70°C, cố định pH 5,0, nồng độ enyzme transglucosidase 10 U/g và duy trì quá trình gắn nhánh trong 12 giờ. Thành phần IMO trong dịch sản phẩm được phân tích bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), kết quả được thể hiện trong Hình 3.19.
Hình 3.19. Ảnh hưởng nhiệt độ gắn nhánh đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, nhiệt độ phản ứng ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả IMO tạo thành. Khi tăng nhiệt độ phản ứng từ 50°C lên 60°C, nồng độ IMO234 tăng từ 39,91 g/l lên 49,84 g/l và là giá trị lớn nhất thu được. Khi nhiệt độ tăng lên 70°C thì hàm lượng IMO234 giảm nhanh xuống còn 28,97 g/l. Xu hướng này cũng được phát hiện tương tự đối với hàm lượng IMO2, IMO3 vàIMO4. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt có nghĩa giữa hàm lượng thành phần IMO tại các trường hợp nhiệt độ khảo sát
khác nhau. Như vậy, tại nhiệt độ 60°C thu được hàm lượng IMO234 là cao nhât. Tuy nhiên, theo thông tin được cung cấp bởi nhà sản xuất, nhiệt độ tối ưu của transglucosidase là 70°C, như vậy, có sự chênh lệch so với kết quả đạt được trong nghiên cứu này. Điều này có thể được giải thích rằng, nhiệt độ tối ưu của transglucosidase được nhà sản xuất tính toán dựa trên quá trình thủy phân giải phóng gốc glucose từ đầu không khử đơn thuần chứ không phải cả quá trình thủy phân và chuyển hóa gốc glucosyl tạo liên kết α- 1,6 glycosidic [7]. Trong những nghiên cứu trước đây về sản xuất IMO trên các nguồn tinh bột khác, giai đoạn gắn nhánh bởi transglucosidase cũng được tiến hành trong khoảng nhiệt độ hoạt động phổ biến từ 55°C đến 60°C và nhận được hàm lượng IMO234 lớn nhất [146], [151]– [154]. Như vậy, lựa chọn nhiệt độ 60°C cho giai đoạn gắn nhánh bởi transglucosidase tổng hợp IMO từ tinh bột khoai lang.
(3) Ảnh hưởng nồng độ enzyme transglucosidase đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh
Tác động của nồng độ enzyme đến hàm lượng IMO được nghiên cứu trong điều kiện thay đổi lượng enyzme transglucosidase bổ sung từ 10 U/g đến 30 U/g, cố định pH gắn nhánh bằng 5,0, nhiệt độ 60°C và và duy trì quá trình gắn nhánh trong 12 giờ. Kết quả hàm lượng IMO sản phẩm được thể hiện trong Hình 3.20.
Hình 3.20. Ảnh hưởng nồng độ enzyme transglucosidase đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, hàm lượng IMO cao nhất thu được tại nồng độ 15 U/g (55,32 g/l) và khi tăng nồng độ enzyme sử dụng lên tới 30 U/g thì hiệu quả tổng hợp IMO lại giảm dần. Cụ thể, nồng độ 30 U/g thu hàm lượng IMO tổng lầ 41,61 g/l. Điều này có thể được giải thích bởi đặc tính enzyme transglucosidase có thể thủy phân đồng thời hai liên kết là α-1,4 và α-1,6 glycosidic, trong đó tốc độ thủy phân liên kết α- 1,4 glycosidic nhanh gấp khoảng hai lần so với α-1,6 glycosidic [146]. Do vậy, khi nồng độ transglucosidase cao, cơ chất oligosaccharide bị thủy phân nhanh tạo glucose tự do [152] làm giảm hàm lượng IMO, hơn nữa, sản phẩm IMO tạo thành
Phân tích thống kê cho thấy trường hợp sử dụng nồng độ transglucosidase là 15 U/g khác biệt với các trường hợp còn lại. Như vậy, lựa chọn nồng độ enzyme transglucosidase là 15 U/g sẽ cho hàm lượng IMO234 cao nhất và kinh tế nhất.
(4) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hàm lượng IMO tạo thành trong giai đoạn gắn nhánh bằng transglucosidase
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng IMO tạo thành bằng thí nghiệm cố định các thông số đã khảo sát: pH 5,0, nhiệt độ 60°C, nồng độ enzyme transglucosidase 15 U/g và duy trì quá trình gắn nhánh trong 6 giờ, 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Phân tích thu được kết quả nồng độ IMO thể hiện trong Hình 3.21.
Hình 3.21. Ảnh hưởng của thời gian gắn nhánh đến hàm lượng IMO tạo thành
Nhận thấy, khi kéo dài thời gian gắn nhánh từ 6 giờ đến 72 giờ, hàm lượng IMO234 thu được có xu hướng tăng và đạt giá trị lớn nhất tại 12 giờ (56,10 g/L). Tiếp đó, hàm lượng IMO2, IMO3, IMO4, đều có xu hướng giảm dần, hàm lượng IMO234 thấp nhất thu được tại 72 giờ. Kết quả trên cho thấy thời gian tối ưu cho giai đoạn gắn nhánh là 12 giờ. IMO được tạo ra bằng cách chuyển các đơn vị glucosyl