pH dịch hóa DE 4,5 6,96 ± 0,16a 5,0 9,81 ± 0,29b 5,5 10,37 ± 0,13b 5,8 11,00 ± 0,26c 6,0 10,32 ± 0,07b 6,5 8,52 ± 0,29d
Nhận thấy, trong khoảng khảo sát pH nêu trên, điều kiện pH 4,5 cho kết quả mức độ thủy phân thấp hơn đáng kể so với các giá trị khảo sát còn lại. Khả năng hoạt động của enzyme α- amylase tăng dần khi thay đổi pH dịch thủy phân từ 4,5 lên 5,8, sau đó có xu hướng giảm dần khi tiếp tục tăng lên đến pH 6,5. Cụ thể, trong khoảng pH 4,5 đến 5,8, giá trị DE dịch sau thủy phân tăng từ 6,96 lên 11,00. Tiếp tục tăng pH, DE dịch thủy phân thu được giảm xuống lần lượt là 10,32 và 8,52 tương ứng với pH 6,0 và 6,5. Tác động của pH đến khả năng hoạt động của enzyme
dịch hóa được giải thích do quá trình ion hóa các nhóm nội phân tử protein, với enzyme α-amylase sự ion hóa diễn ra ở nhóm liên kết với cơ chất và nhóm xúc tác [155]. Kết quả thu được trong nghiên cứu này gần với điều kiện hoạt động tối thích của chế phẩm Spezyme Xtra (pH 5,5) được báo cáo bởi Shanavas cùng cộng sự (2011) [252] và hoàn toàn phù hợp với khoảng pH tối ưu 5,0 đến 6,7 được khuyến nghị bởi nhà sản xuất Dupont. Phân tích thống kê cho thấy DE tại pH phản ứng 5,8 cho kết quả cao nhất và có sự khác biệt với các giá trị còn lại.
Như vậy, lựa chọn pH 5,8 cho quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang bằng chế phẩm Spezyme Xtra.
(5) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase đến quá trình dịch hóa được tiến hành trên dịch tinh bột nồng độ 25%, cố định nhiệt độ 80 °C, pH 5,8, nồng độ enzyme thay đổi từ 0,3 CU/g đến 2,5 CU/g, duy trì điều kiện thủy phân thời gian 30 phút. Kết quả thu được thể hiện trong Hình 3.14.
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình dịch hóa
Sau cùng thời gian phản ứng, khi tăng nồng độ enzyme α- amylase từ 0,5 CU/g đến 2,5 CU/g, mức độ thủy phân thu được có sự chênh lệch đáng kể. Cụ thể, trong khoảng nồng độ 0,3 CU/g đến 1,0 CU/g, mức độ thủy phân thay đổi rõ rệt nhất, tăng từ 8,29 đến 15,03. Tiếp tục tăng nồng độ enzyme phản ứng lên 1,5 CU/g, 2,0 CU/g và 2,5 CU/g, DE có xu hướng tăng chậm hơn và lần lượt đạt giá trị 16,45, 17,25 và 18,51. Phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt này có nghĩa giữa các giá trị thu được. Có thể thấy, khoảng khảo sát nồng độ enzyme chưa đạt đến ngưỡng bị ức chế do chính sự tương tác giữa các phân tử enzyme, do đó, khi tăng nồng độ enzyme, khả năng tiếp xúc giữa phân tử enzyme và cơ chất tăng dẫn đến quá trình thủy phân được thực hiện nhanh chóng [253]. Tuy nhiên, khả năng thủy phân cải thiện không đáng kể sau khi nồng độ enzyme đạt 1 CU/g. Nhằm hướng tới mục tiêu nghiên cứu ứng dụng, việc giảm thiểu chi phí là vấn đề quan trọng. Do đó, nồng độ enzyme α-
Như vậy, lựa chọn nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g với chế phẩm Spezyme Xtra bổ sung vào quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang.
(6) Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra
Tiến hành nghiên cứu trên dịch tinh bột có nồng độ chất khô 25%, pH 5,8, nhiệt độ phản ứng 80 °C, nồng độ enzyme α- amylase 1,0 CU/g chất khô và lấy mẫu sau thời gian phản ứng 15 phút, 30 phút cho tới 150 phút (sau mỗi 30 phút). Kết quả ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa bằng chế phẩm enzyme Spezyme Xtra được thể hiện qua Hình 3.15.
Hình 3.15. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến quá trình dịch hóa
Nhận thấy, thời gian dịch hóa có ảnh hưởng đáng kể đến DE dịch sau thủy phân. Cụ thể, tốc độ phản ứng nhanh được thể hiện rõ trong 60 phút đầu thông qua DE dịch sản phẩm tăng nhanh từ 12,35 đến 18,76. Tiếp tục duy trì điều kiện thủy phân đến 150 phút, phản ứng có xu hướng thủy phân chậm dần và dịch thủy phân cuối có DE đạt 22,2. Kết quả này có thể được giải thích do tốc độ thủy phân của enzyme α- amylase trên chuỗi dextrin mạch dài diễn ra nhanh hơn so với chuỗi mạch ngắn. Khi quá trình thủy phân diễn ra, dung dịch hóa lỏng tăng dần số lượng chuỗi mạch ngắn, do đó, quá trình thủy phân diễn ra chậm lại. Quá trình dịch hóa tinh bột sắn bằng Spezyme Xtra có kết quả tương tự được quan sát bởi Shanavas và cộng sự (2011) [252]. Bên cạnh đó, enzyme α- amylase chỉ có thể thủy phân liên kết α-1,4 glycosidic, không thể thủy phân vị trí nhánh chứa liên kết α-1,6 glycosidic, do đó tốc độ thủy phân dịch tinh bột còn có thể được tăng lên đáng kể nếu sử dụng enzyme phân cắt liên kết nhánh. Do đó, khống chế thời gian dịch hóa dừng lại sau 60 phút là phù hợp, và đây sẽ là dịch nguyên liệu cho giai đoạn đường hóa tiếp theo dưới tác dụng của enzyme β- amylase và pullulanase.
Trong một số nghiên cứu đã công bố, giai đoạn dịch hóa trong quy trình tổng hợp IMO từ tinh bột được kiểm soát với các mức độ thủy phân khác nhau. Điều kiện dừng hoạt động enzyme α-amylase trong nghiên cứu trên bột chuối của
Chockchaisawasdeea và cộng sự (2013) [146]là khi toàn bộ tinh bột đã được thủy phân thành dextrin (không tạo màu xanh lam khi thử với dung dịch KI/ I2), cách tiến hành tương tự được áp dụng trong nghiên cứu của Basu và cộng sự (2016) [147]. Với tinh bột hạt dẻ, Cui và cộng sự (2017) [154] thực hiện dịch hóa trong thời gian 120 phút, DE dịch đạt 13,8. Trong báo cáo của Niu và cộng sự (2017) [151], dịch tinh bột sau khi xử lí với enzyme α-amylase có DE khoảng 25.
Như vậy, quá trình dịch hóa tinh bột khoai lang trong quy trình chuyển hóa tạo IMO được thực hiện với dịch tinh bột có nồng độ 25% w/v trong điều kiện nhiệt độ 80 °C, pH 5,8, nồng độ enzyme α- amylase (chế phẩm Spezyme Xtra) 1,0 CU/g và duy trì phản ứng trong thời gian 60 phút. Sau quá trình dịch hóa, DE dịch thủy phân đạt 18,76. Vô hoạt enzyme α- amylase bằng axit lactic đặc đến pH 3,0 và chuẩn bị cho giai đoạn đường hóa tiếp theo.
3.3.1.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
(1) Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Tiến hành thí nghiệm trên dịch thủy phân sau giai đoạn dịch hóa ở điều kiện nhiệt độ thay đổi từ 45 °C đến 65 °C và cố định pH 5,0, nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa được thể hiện trong Bảng 3.18.
Bảng 3.18. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Nhiệt độ đường hóa (°C) DE
45 28,63 ± 1,39a
50 31,75 ± 0,53b
55 31,59 ± 0,61b
60 26,42 ± 0,86c
65 18,13 ± 0,43d
Nhận thấy, khả năng thủy phân tốt nhất của phản ứng đường hóa thu được ở điều kiện nhiệt độ 50°C và 55°C, thể hiện ở giá trị đương lượng đường khử DE cao nhất và khác biệt có nghĩa với các giá trị còn lại. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ đường hóa từ 45°C đến 55°C, DE của dịch sau đường hóa tăng từ 28,63 đến 31,75. Tiếp tục tăng nhiệt độ đường hóa lên 60°C và 65°C, mức độ thủy phân DE giảm nhanh lần lượt là 26,42 và 18,13. Nhiệt độ hoạt động tối thích của enzyme β- amylase từ đại mạch và pullulanase lần lượt là 60°C và 55- 60°C (thông tin do nhà sản xuất cung cấp). Tuy nhiên, nhiệt độ ổn định của chúng tương ứng chỉ dưới 60°C và dưới 50°C, chính vì thế, DE thu được thấp hơn ở nhiệt độ lớn hơn hoặc bằng 60°C. Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Niu và cộng sự (2017) [151] đã chỉ ra hai
được trên 50% hoạt tính tối đa trong khoảng nhiệt độ 50-60℃. Giai đoạn đường hóa sản xuất IMO trong báo cáo của Saman và cộng sự (2019) [152] cũng lựa chọn nhiệt độ 50°C cho việc sử dụng đồng thời hai enzyme gồm pullulanase và β- amylase cho. Do đó, nhiệt độ 50- 55°C là điều kiện hoạt động tốt nhất cho cả hai enzyme.
Như vậy, lựa chọn điều kiện nhiệt độ 50°C cho giai đoạn đường hóa bằng β- amylase và pullulanase vẫn tạo điều kiện thủy phân tốt, hơn nữa tiết kiệm chi phí năng lượng so với 55℃.
(2) Ảnh hưởng pH đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
Nghiên cứu được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ đường hóa 50°C, pH thay đổi từ 4,5 đến 6,5 và cố định nồng độ β-amylase 5 U/g, nồng độ pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng 3 giờ. Kết quả thu được về sự ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa được mô tả trong Bảng 3.19.
Bảng 3.19. Ảnh hưởng pH đến sự hoạt động của enzyme β-amylase và pullulanase trong giai đoạn đường hóa
pH đường hóa DE 4,5 19,74 ± 0,57a 5,0 31,75 ± 0,53bc 5,5 31,76 ± 1,17bc 6,0 32,78 ± 1,01c 6,5 30,98 ± 0,87b
Nhận thấy, khả năng hoạt động của hai enzyme tương đối ổn định trong khoảng pH 5,0 – 6,0 với đương lượng đường khử dao động từ 31,75 đến 32,78. Ngoài khoảng pH trên, phản ứng cho kết quả DE dịch sau thủy phân thấp hơn là 30,98 và 19,74 tương ứng với pH 6,5 và pH 4,5. Điều kiện pH tối ưu được cung cấp bởi Megazyme của β-amylase và pullulanase lần lượt là 6,0 và 4,5 - 5,5. Do đó, ở pH 4,5 chỉ riêng hoạt động của enzyme pullulanase đạt tối ưu, ngược lại, enzyme β- amylase lại hoạt động không hiệu quả tại pH này dẫn đến DE dịch sau phản ứng thấp hơn đáng kể so với các điều kiện còn lại. Phân tích thống kê cho thấy DE tại pH 6,0 có giá trị cao nhất và khác biệt với các giá trị còn lại. Do đó, pH 6,0 là điều kiện tối thích cho sự hoạt động đồng thời của hai enzyme β-amylase và pullulanase trong điều kiện khảo sát của nghiên cứu. Hoạt tính của enzyme β-amylase và pullulanase cùng nguồn gốc được phân tích trong nghiên cứu của Niu và cộng sự (2017) [151] cũng cho thấy hoạt tính cao nhất khi sử dụng đồng thời cả hai enzyme thu được trong khoảng pH 5,0 đến 6,0 và đạt trên 50% hoạt tính tối đa của chúng. Ngoài ra, điều kiện pH 6,0 cũng được Saman và cộng sự (2019) [152] lựa chọn cho quá trình đường hóa sử dụng hai enzyme gồm β-amylase và pullulanase trong quy trình sản xuất IMO.
Như vậy, pH 6,0 được lựa chọn cho giai đoạn đường hóa của quá trình tổng hợp IMO từ tinh bột khoai lang.
(3) Ảnh hưởng nồng độ enzyme β-amylase đến quá trình đường hóa
Tiến hành thí nghiệm bằng cách thay đổi nồng độ enzyme β- amylase từ 1 CU/g đến 11 CU/g, điều chỉnh pH = 6,0, cố định nhiệt độ đường hóa 50°C, nồng độ enzyme pullulanase 0,6 U/g và thời gian phản ứng duy trì trong 3 giờ. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.20.