Năm Tác giả Tên cây Hoạt tính sinh học
2010 Sharma và các
cộng sự[74] C.decidua Cải thiện các triệu chứng của chuột bị tiểu đường do streptozocin gây ra.
2010 Kanaujia và
các cộng sự[44] C.moonii Chất Insulinometic giúp cải thiện sự hấp thụ glucozo trong máu.
2008 Selvamani và
các cộng sự[72] C.sepiaria Làm lượng đường trong máu của cơ thể giảm từ 100-300mg/kg.
Uống liều đầu tiên giúp giảm lượng đường trong máu từ 100-300mg/kg ở chuột bị tiểu đường do streptozocin gây ra 9-15%, 894mg/kg gây độc cấp tính (LD50 - liều lượng gây chết 50%)
Chương 2 THỰC NGHIỆM THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
- Dung môi sử dụng thuộc loại tinh khiết là: n - hexane, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n - butanol, ethanol, methanol, nước cất.
-Sắc ký cột thường silica gel (200-300 mesh) (0,040-0,063 mm). Bản mỏng TLC thuộc loại 254F (Merck).
-Sắc ký pha đảo silica gel C18 (5-10 micromet), bản mỏng RP-TLC thuộc loại 254F-RP (Merck).
2.1.2. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học
-FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), sRB (Sigma).
-Đĩa chứa tế bào 96 giếng (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
-Chất so sánh: Ellipticine.
-Các dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier (Đại học Milan, Italia) cung cấp.
2.1.3. Thiết bị
- Máy cất quay chân không IKA, cột sắc ký thủy tinh, dụng cụ thủy tinh khác. -Máy đo khối phổ Mass Spectrometter (MS) và máy đo Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy Bruker 500MHz (Khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội).
-Đèn UV 254nm. Cân phân tích, máy đọc OD ELISA Plate Reader (Bio- Rad).
-Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính và bản mỏng nhôm silica gel tráng sẵn (dày 0.2 mm).
2.2. Phương pháp sử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được chất phân lập được
2.2.1. Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật
- Lá của cây Cáp Đồng văn được thu hái trên cao nguyên đá Đồng Văn tại tỉnh Hà Giang - Việt Nam vào tháng 6 năm 2018 là các mẫu tươi. Mẫu đc PGS. TS. Sỹ Danh Thường, khoa Sinh học – ĐHSP Thái Nguyên kiểm tra và định tên khoa học.
- Lá của loài này được sấy khô ở 50oC trong 3 ngày, bảo quản trong túi nilon dùng để nghiên cứu.
2.2.2. Chiết xuất
- Mẫu lá của cây Cáp Đồng văn sau khi lấy về được đem cắt nhỏ, sấy khô, khối lượng 5 kg, chiết hồi lưu với ethanol 90% ở nhiệt độ 70oC trong thời gian là 4 giờ và lặp lại 3 lần. Cất thu dung môi được cao chiết ethanol. Một phần cao chiết ethanol được phân bố đều trong lượng nước vừa đủ. Dịch chiết thu được sau khi phân bố trong nước được chiết lần lượt với n-hexane (Hex), ethyl acetate (EA) và n-butanol (BuOH). Sau đó cất thu dung môi dưới áp suất thấp để thu các cao chiết tổng số.
2.2.3. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất.
2.2.3.1. Định tính polyphenol [2].
a) Phản ứng với muối sắt (III).
-Thuốc thử: dung dịch muối Fe3+.
-Thí nghiệm: Lấy 5ml dịch chiết tổng, cho thêm 0,5ml muối Fe3+. Quan sát hiện tượng. Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
-Thuốc thử: acid H2SO4 đặc.
-Thí nghiệm: Lấy vào ống nghiệm 2-3 ml dung dịch cao chiết, cho thêm vào 2 giọt H2SO4 đặc. Quan sát hiện tượng. Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm, đối với chalcone và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi, flavanon cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcone.
2.2.3.2. Định tính các flavonoid[2].
Thuốc thử: HCl đặc 36% và Mg.
Thí nghiệm: Lấy 0.1 g cặn chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 5 ml methanol, đun nóng cho cặn chiết tan hết rồi lọc bằng giấy lọc. Tiếp theo lấy 2 ml nước cất cho vào ống nghiệm, rồi cho từ từ một ít bột kim loại Mg, tiếp tục cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun nóng hỗn hợp trong bình cách thuỷ vài phút đến và quan sát hỗn hợp trong ống nghiệm, thấy hỗn hợp có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoid.
2.2.3.3. Định tính alkaloid[2].
* Các thuốc thử sử dụng. - Thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch A: Hòa tan 0.05 g bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml dung dịch acetic acid 20%. Dung dịch B: 5 ml dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A, 5 ml dung dịch B và 70 ml H2O.
- Thuốc thử Mayer.
Dung dịch A: hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml H2O. Dung dịch B: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước cất vào cho vừa đủ 100ml.
* Thí nghiệm: Lấy 0,05 g cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều rồi lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml nước lọc acid rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. * Hiện tượng:
+ Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam. + Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.
2.2.3.4. Định tính các Courmarin[2].
* Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
* Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến khi sôi, sau đó lấy ra để nguội rồi thêm vào 4 ml nước cất. Nếu dung dịch ở ống 2 trong hơn ống 1 có thể xem là dương tính. Mặt khác nếu tiếp tục đem acid hóa ống 2 bằng một vài giọt dung dịch acid HCl đậm đặc, nếu dung dịch trong suốt có xuất hiện vẩn đục và có khả năng tạo kết tủa là dương tính với courmarin.
2.2.3.5. Phản ứng của Steroid[2].
- Thuốc thử: Dung dịch Liebermann-Burchard.
- Thí nghiệm: Hòa tan cao tổng trong ethanol. Lấy 1ml dung dịch này cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài giọt thuốc thử Liebermann-Burchard. Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, các màu này thường rất bền không bị đổi theo thời gian; thì chứng tỏ mẫu nghiên cứu có steroid.
2.2.4. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai chiều HSQC và HMBC, NOESY và phổ khối lượng ESI-MS.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo tại Khoa Hóa học - Đại Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Phổ khối lượng thực hiện tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam.
2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
2.3.1. Vật liệu và hóa chất
-FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), sRB (Sigma)
-Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
- Chất tham khảo: Ellipticine. - Các hóa chất thông thường khác.
- Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.
- Các dòng tế bào do GS. J M Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US cung cấp.
- Các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu:
+ A549: Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma). + Hela: Ung thư buồng trứng (human ovarian carcinoma).
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
-Các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1.0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).
-Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37℃, 5% CO2.
2.3.3. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp
của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
-Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp.
-Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
-Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 µg/ml; 20 µg/ml; 4 µg/ml và 0.8 µg/ml.
-Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (180µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloroacetic acid - TCA.
-Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37℃, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.
-10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút. -Đọc kết quả OD ở bước sóng 515 - 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad).
-Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD (chất thử) - OD (ngày 0)] x 100 % ức chế = 100% -
OD (đối chứng âm) - OD (ngày 0)
- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10 µg/ml; 2 µg/ml; 0.4 µg/ml; 0.08 µg/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO10% được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4.
- Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), cặn chiết được coi là có hoạt tính tốt với IC50 ≤ 20 µg/ml, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt khi IC50 ≤ 5 µM [83].
Hoạt tính được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, do PGS. TS. Đỗ Thị Thảo thực hiện.
2.4. Phân lập, tinh chế các hợp chất
Phần cao chiết EA (45 gam) dùng để phân lập các chất trên sắc ký cột silica gel. Cao chiết hòa tan trong EA và được hấp phụ trên silica gel (Merck, kích thước hạt 63-20 µm). Chuẩn bị nhồi cột bằng 600 gam silica gel (Merck, kích thước hạt 63-20 µm) vào cột kích thước 7x100 cm. Cột được ổn định bằng dung môi n- hexane. Hệ dung môi sắc ký: acetone/n-hexane với tỉ lệ từ 1:20 đến 1/1(v/v). Thu được 6 phân đoạn. Kiểm tra các phân đoạn thu được sau khi kiểm tra các lọ hứng bằng sắc ký lớp mỏng TLC.
Tại phân đoạn 3, tiếp tục được chạy sắc ký cột silica gel pha thuận với hệ dung môi rửa giải là acetone/n-hexane với tỉ lệ 1/15 (v/v) thu được chất rắn không màu 1 (35 mg).
Tại phân đoạn 1, sau khi gộp và chưng cất bớt dung môi, để trong phòng thí nghiệm, sau 12h xuất hiện chất rắn không màu kết tủa, lọc kết tủa và rửa nhiều lần bằng acetone trên phễu lọc thu được chất rắn không màu 2 (22 mg).
Tại phân đoạn 6, sau khi gộp và chưng cất bớt dung môi, để trong phòng thí nghiệm, sau 6h xuất hiệt chất rắn màu vàng nhạt, lọc kết tủa và rửa nhiều lần bằng acetone trên phễu lọc thu được chất rắn không màu 3 (13 mg) (Hình 2.1).
Các chất rắn được sấy khô và bảo quản trong tủ lạnh để dùng thực nghiệm đo phổ NMR, MS và đánh giá hoạt tính sinh học.
Cao chiết EA (45 gam)
Phân đoạn 1 Phân đoạn 2 Phân đoạn 3 Phân đoạn 4 Phân đoạn 5 Phân đoạn 6
SKC
Pha động: n-hexane/acetone với tỉ lệ 1:20 đến 1:1 (v/v) Chất 1 (35 mg) Chất 2 (22 mg) Lọc thu chất rắn Lọc thu chất rắn Chất 3 (13 mg) Dịch lọc SKC Pha động: n-hexane/ acetone với tỉ lệ 15/1 (v/v) Phân đoạn 3.1 Dịch lọc Hình 2.1: Sơ đồ phân lập chất 1-3
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả định tính nhóm hợp chất
Dựa trên kết quả phân tích định tính thành phần một số nhóm hợp chất có trong cao chiết ethanol của nhóm nghiên cứu, chúng tôi tiếp tục phân tích định tính cao chiết EA để làm cơ sở cho việc phân lập hợp chất. Các bước thực nghiệm được trình bày ở mục 2.2.3.
Kết quả của nghiên cứu đã được tổng hợp ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả định tính một số nhóm chất hữu cơ có trong cao chiết ethanol và cao chiết EA Số
TT Nhóm chất Phản ứng
Kết quả
Cao chiết ethanol Cao chiết phân đoạn EA
1 Phenolic
dd FeCl3 5% Chuyển màu xanh Chuyển màu xanh H2SO4 đặc Hiện tượng không
rõ
Màu nâu hồng
2 Alkaloid
Dragendoff Có kết tủa màu vàng
Có kết tủa vàng
Mayer Hiện tượng không rõ
Vẩn đục
3 Flavonoid Mg/HCl đặc Có hiện tượng Có hiện tượng 4 Coumarin NaOH đặc Có kết tủa bông Có kết tủa bông 5 Steroid Liberman-Bourchar Màu nâu thẫm Màu nâu thẫm
Từ kết quả được tổng hợp ở bảng 3.1, ta thấy trong cao chiết phân đoạn EA có các phản ứng định tính có hiện tượng rõ ràng hơn trong cao chiết ethanol (ở 2 nhóm hợp chất: Phenolic và Alkaloid). Kết quả phân tích định tính này có ý nghĩa quan trọng để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả xác định cấu trúc của hợp chất
3.2.1. Phân tích cấu trúc hợp chất 1
Chất 1 được thực nghiệm đo các phổ NMR; phổ khối lượng (MS) và so sánh với tài liệu tham khảo để xác định công thức cấu tạo.
Hình 3.1. Phổ 1H-NMR của chất 1
Phổ 1H-NMR của chất 1 cho 6 tín hiệu singlet của 6 nhóm methyl liên kết với nguyên tử carbon bậc 4 tại δH 0.82, 0.91, 0.97, 1.07 và 1.26 (ppm), 02 tín hiệu cộng hưởng của 2 nhóm methyl liên kết với nhóm methylen tại 0.81 (d, J
= 9.5 Hz, 3H) và 0.92 (d, J = 9.5 Hz, 3H). Trong đó hai nhóm methyl tại C29 và C30 cùng cộng hưởng tại vị trí 1.26 ppm. Trên phổ 1H-NMR của 1 còn xuất hiệu tín hiệu cộng hưởng của nguyên tử H trong liên kết đôi tại δH 5.53 ppm tại C12. Đồng thời, tín hiệu cộng hưởng của nguyên tử H-3 tại δH 3.19 (dd, J = 11.6, 4.6
Hz, 1H). Các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng này tương đối giống với các tín hiệu cộng hưởng của beta-amyrin.
Bảng 3.2: Giá trị độ chuyển dịch hóa học của 1 (δ ppm, J Hz)) TT 13C (ppm, 400 MHz) [51] 1H (δ ppm, J Hz) 13C (ppm, 500 MHz) 1 38.76 2.03, 1.33 41.34 2 27.25 1.59 (m) 27.16 3 78.47 3.19 (dd, J = 11.6, 4.6 Hz, 1H) 79.08 4 38.87 38.99 5 55.22 0.78 (m) 55.54 6 18.33 1.48, 1.61 (m) 18.81 7 33.02 1.25, 1.34 (m) 33.11 8 39.01 38.01 9 47.45 0.93-0.96 (m) 48.77 10 38.67 37.75 11 23.22 1.67 (m) 28.81 12 115.18 5.53 (m) 116.88 13 158.34 158.09 14 52.71 49.29 15 31.51 1.60 (m) 33.71 16 17.17 1.62 (m) 17.51 17 47.42 38.78 18 42.01 1.91 (dd, J = 14.7, 3.2 Hz,) 37.72 19 39.50 1.23 (m) 37.58 20 30.69 0.94 (m) 33.36 21 36.91 1.27, 1.32 (m) 36.69 22 31.82 1.34, 1.46 (m) 35.80 23 15.51 0.92 (d, J = 9.5 Hz, 3H). 15.43 24 16.02 0.81 (d, J = 9.5 Hz, 3H). 15.46 25 21.45 0.91 (s) 21.32 26 23.57 1.09 (s) 25.91 27 29.33 0.82 (s) 29.84 28 27.97 0.97 (s) 28.01 29-30 29.58 1.26 (s) 29.71