2. Mục tiêu của đề tài
1.7. Những nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các loài trong chi Capparis
Thành phần hóa học chính của loài trong chi Capparis là alkaloid, flavonoid, steroid. Các hợp chất này có tác dụng chủ yếu trong việc chống oxi hóa, hoạt tính kháng viêm, ức chế tế bào ung thư, giảm lượng đường trong máu cải thiện biến chứng bệnh tiểu đường, hạ huyết áp,...
Ung thư thực chất là sự phát triển của các gốc tự do (tế bào ung thư) dẫn đến sự phá hủy cơ quan trong cơ thể. Hiện nay có rất nhiều phương pháp điều trị ung thư: phẫu thuật, xạ trị, hóa trị liệu,...Ngoài ra phương pháp điều trị “nhẹ nhàng” nhất là sử dụng dược liệu từ thực vật, các loại thực vật này chứa chất ức chế ung thư, sau mỗi lần sử dụng sẽ ngăn chặn sự phát triển hay làm giảm tế bào ung thư.
Dưới đây là một số nghiên cứu chứng minh khả năng ức chế tế bào ung thư của chi Capparis:
Bảng 1.6: Hoạt tính ức chế tế bào ung thư ở chi Capparis
Năm Tác giả Tên cây Hoạt tính sinh học
2008 Cui và các
cộng sự[25] C.spinosa
Gây ra sự chết rụng tế bào ung thư trong tế bào ung thư biểu mô dạ dày SGC-7901 bằng tăng lượng Ca++ nội bào.
2008 Ji và các
cộng sự[42] C.spinosa
Bằng phương pháp MTT, làm giảm sự tăng trưởng của tế bào ung thư gan HepG2 ở người, IC50 471,53mg/L, 75% chất gây chết rụng tế bào ung thư liều cao.
2009
Matsuyama và các cộng
sự[48]
C.spinosa
Điều chỉnh sự tăng melanogenesis trong các tế bào u ác tính B16 của chuột mà không gây độc cho tế bào bằng cách kích thích biểu hiện của tyrosinase.
2009 Yang và các
cộng sự[88] C.spinosa
Ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư SKOV-3, Canpan-2, HepG-2, SGC-7901 trong ống nghiệm, IC50 là 46.160 μg/mL và 66.546 μg/mL đối với HepG-2 và SGC- 7901,resp.
2010 Yu và các
cộng sự[91] C.spinosa
Gây ra sự chết rụng tế bào ung thư trong tế bào ung thư biểu mô dạ dày SGC-7901 bằng cách
tăng hàm lượng ROS, caspase-9, Ca++ nội bào.
1.7.2. Hoạt tính chống oxy hóa
Sự căng thẳng oxi hóa hay còn được gọi là stress oxy hóa nó là “chất thải” hay tác dụng phụ của quá trình hoạt động và sinh sống. Sự căng thẳng oxy hóa này cũng là nguyên nhân tiềm tàng của người bệnh và gây rối loạn chức năng từ đó sinh ra rất nhiều bệnh nguy hiểm: bệnh tim, bệnh tâm thần, ung thư, tâm thần phân liệt,...Rất nhiều các nghiên cứu đã chứng minh: chiết xuất từ Capparis có khả năng làm giảm quá trình oxy hóa nhiều nhiều chất; giúp cho các cơ quan của người bệnh khỏe lại, giảm xơ vữa động mạch, giúp bộ não luôn linh hoạt và tăng cường hệ miễn dịch cho cơ thể. Một số ví dụ về các nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của Capparis như bảng dưới đây.
Bảng 1.7: Hoạt tính chống oxy hóa ở chi Capparis
Năm Tác giá Tên cây Hoạt tính sinh học
1997b
Yadav và các cộng
sự[87]
C.decidua
Giúp chuột bị tiểu đường, làm giảm lượng peroxide do alloxan gây ra, tăng sự hoạt động của SOD trong hồng cầu; có thể làm giảm độc tính của peroxide bằng cách tăng sự phân hủy của nó bởi CAT. Do đó cần phải thay đổi hàm lượng SOD, CAT để giảm sự oxy hóa hay căng thẳng oxy hóa. 1997
Yadav và các cộng
sự[87]
C.decidua
Ở chuột thí nghiệm bị tiểu đường do streptozocin gây ra, nó làm giảm glutathione, SOD, CAT và glutathione peroxidase trong tim, gan, thận; ngăn không cho lipid peroxide tăng, loại bỏ các gốc tự do trong hồng cầu, gan của chuột; làm tăng khả năng hoạt động của CAT, SOD trong hồng cầu, gan, thận, tim có thể giúp trung hòa lượng H2O2 trong cơ thể.
2009 Ali và các
cộng sự[11] C.decidua
2011a Dangi và
Năm Tác giá Tên cây Hoạt tính sinh học 1999 Gadgoli và Mishra[32] C.spinosa
Hoạt tính chống độc sau khi tiếp xúc với CCl4 hoặc
paracetamol (một loại thuốc hạ sốt và giảm đau nhẹ) của chuột thí nghiệm hoặc thioacetamide
(chất gây ung thư loại 2B) hay tiếp xúc với
galactosamine chất gây độc cho gan của tế bào gan chuột trong ống nghiệm.
2002
Germano và các cộng sự[35]
C.spinosa
Có tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ trong cơ thể sống có chứa ion Fe2+, chuyển hóa lipid peroxide trong gan chuột và tự oxy hóa loại bỏ ion Fe2+.
2010
Cao và các cộng
sự[18]
C.spinosa Giảm sự oxy hóa trong các nguyên bào sợi của da
trong ống nghiệm.
1.7.3. Hoạt tính kháng viêm
Viêm nhiễm là nguyên nhân hoặc ít nhất là yếu tố có liên quan tác động mạnh mẽ nhất đến sức khỏe người bệnh. Hay nói cách khác, viêm là phản ứng bảo vệ bình thường của cơ thể trước các tổn thương do vi khuẩn, vi rút hoặc một yếu tố nào khác gây ra. Từ xa xưa, con người đã nghiên cứu và tìm ra chi
Capparis có tác dụng kháng viêm và điều trị viêm. Dưới đây là một số nghiên
cứu chứng minh khả năng kháng viêm của chi Capparis như bảng sau:
Bảng 1.8: Hoạt tính sinh học kháng viêm ở chi Capparis
Năm Tác giả Tên cây Hoạt tính sinh học
1986 Ageel và các
cộng sự[5] C.decidua Khả năng kháng viêm trong xét nghiệm phù tai do carrageenan gây ra ở chuột. 2005 Trombetta và
các cộng sự[82] C.spinosa
Với 14 mg / kg có thể ức chế được triệu chứng co thắt phế quản do kháng nguyên ở chuột lang và dung dịch 1% ức chế triệu
Năm Tác giả Tên cây Hoạt tính sinh học
chứng ban đỏ da do histamine gây ra ở người trẻ.
2008 Ying[90] C.spinosa
Có hiệu quả đối với viêm cầu thận mãn tính, bệnh thận IGA, viêm thận kẽ mãn tính, xơ cứng cầu thận phân đọa khu trú (là nguyên nhận phổ biến cho chứng thận hư ở trẻ).
2009 Wang và các
cộng sự[84] C.heyneana Khả năng kháng viêm và giảm đau qua da.
2011 Sini và các
cộng sự[75] C.zeylanica
Khả năng chống viêm loét dạ dày do ethanol và indomethacin cao (>80%), giúp giảm nguy cơ bị ung thư dạ dày, giảm nồng độ axit trong dạ dày và điều trị được tình trạng viêm loét.
1.7.4. Hoạt tính điều trị đái tháo đường
Bệnh đái tháo đường hay còn gọi là bệnh tiểu đường, là loại bệnh bị rối loạn quá trình chuyển hóa cacbonhydrate, khiến lượng này bị giảm hoặc thiếu, lượng lipid và protein tăng khiến lượng glucozo trong máu tăng cao. Di chứng của bệnh để lại rất nghiệm trọng. Dưới đây là một số nghiên cứu thí nghiệm trên động vật bị đái tháo đường, để chứng minh hoạt tính sinh học của chi Capparis:
Bảng 1.9: Tác dụng điều trị đái tháo đường ở chi Capparis
Năm Tác giả Tên cây Hoạt tính sinh học
2010 Sharma và các
cộng sự[74] C.decidua Cải thiện các triệu chứng của chuột bị tiểu đường do streptozocin gây ra.
2010 Kanaujia và
các cộng sự[44] C.moonii Chất Insulinometic giúp cải thiện sự hấp thụ glucozo trong máu.
2008 Selvamani và
các cộng sự[72] C.sepiaria Làm lượng đường trong máu của cơ thể giảm từ 100-300mg/kg.
Uống liều đầu tiên giúp giảm lượng đường trong máu từ 100-300mg/kg ở chuột bị tiểu đường do streptozocin gây ra 9-15%, 894mg/kg gây độc cấp tính (LD50 - liều lượng gây chết 50%)
Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và thiết bị
2.1.1. Hóa chất
- Dung môi sử dụng thuộc loại tinh khiết là: n - hexane, dichloromethane, acetone, ethyl acetate, n - butanol, ethanol, methanol, nước cất.
-Sắc ký cột thường silica gel (200-300 mesh) (0,040-0,063 mm). Bản mỏng TLC thuộc loại 254F (Merck).
-Sắc ký pha đảo silica gel C18 (5-10 micromet), bản mỏng RP-TLC thuộc loại 254F-RP (Merck).
2.1.2. Hóa chất và tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học
-FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), sRB (Sigma).
-Đĩa chứa tế bào 96 giếng (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
-Chất so sánh: Ellipticine.
-Các dòng tế bào ung thư dùng trong nghiên cứu do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier (Đại học Milan, Italia) cung cấp.
2.1.3. Thiết bị
- Máy cất quay chân không IKA, cột sắc ký thủy tinh, dụng cụ thủy tinh khác. -Máy đo khối phổ Mass Spectrometter (MS) và máy đo Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo trên máy Bruker 500MHz (Khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội).
-Đèn UV 254nm. Cân phân tích, máy đọc OD ELISA Plate Reader (Bio- Rad).
-Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính và bản mỏng nhôm silica gel tráng sẵn (dày 0.2 mm).
2.2. Phương pháp sử lý mẫu thực vật, chiết tách và xác định cấu trúc các chất phân lập được chất phân lập được
2.2.1. Mẫu nghiên cứu và xử lý mẫu thực vật
- Lá của cây Cáp Đồng văn được thu hái trên cao nguyên đá Đồng Văn tại tỉnh Hà Giang - Việt Nam vào tháng 6 năm 2018 là các mẫu tươi. Mẫu đc PGS. TS. Sỹ Danh Thường, khoa Sinh học – ĐHSP Thái Nguyên kiểm tra và định tên khoa học.
- Lá của loài này được sấy khô ở 50oC trong 3 ngày, bảo quản trong túi nilon dùng để nghiên cứu.
2.2.2. Chiết xuất
- Mẫu lá của cây Cáp Đồng văn sau khi lấy về được đem cắt nhỏ, sấy khô, khối lượng 5 kg, chiết hồi lưu với ethanol 90% ở nhiệt độ 70oC trong thời gian là 4 giờ và lặp lại 3 lần. Cất thu dung môi được cao chiết ethanol. Một phần cao chiết ethanol được phân bố đều trong lượng nước vừa đủ. Dịch chiết thu được sau khi phân bố trong nước được chiết lần lượt với n-hexane (Hex), ethyl acetate (EA) và n-butanol (BuOH). Sau đó cất thu dung môi dưới áp suất thấp để thu các cao chiết tổng số.
2.2.3. Phương pháp định tính các nhóm hợp chất.
2.2.3.1. Định tính polyphenol [2].
a) Phản ứng với muối sắt (III).
-Thuốc thử: dung dịch muối Fe3+.
-Thí nghiệm: Lấy 5ml dịch chiết tổng, cho thêm 0,5ml muối Fe3+. Quan sát hiện tượng. Tùy theo số lượng và vị trí nhóm hydroxyl trong phân tử polyphenol mà cho màu lục, xanh hoặc nâu.
-Thuốc thử: acid H2SO4 đặc.
-Thí nghiệm: Lấy vào ống nghiệm 2-3 ml dung dịch cao chiết, cho thêm vào 2 giọt H2SO4 đặc. Quan sát hiện tượng. Khi nhỏ H2SO4 lên các dẫn xuất của flavon và flavonol thì cho màu vàng đậm, đối với chalcone và auron cho màu đỏ, đỏ thắm và đỏ tươi, flavanon cho màu đỏ da cam do sự chuyển thành chalcone.
2.2.3.2. Định tính các flavonoid[2].
Thuốc thử: HCl đặc 36% và Mg.
Thí nghiệm: Lấy 0.1 g cặn chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 5 ml methanol, đun nóng cho cặn chiết tan hết rồi lọc bằng giấy lọc. Tiếp theo lấy 2 ml nước cất cho vào ống nghiệm, rồi cho từ từ một ít bột kim loại Mg, tiếp tục cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun nóng hỗn hợp trong bình cách thuỷ vài phút đến và quan sát hỗn hợp trong ống nghiệm, thấy hỗn hợp có màu từ vàng, đỏ đến xanh là dương tính với các flavonoid.
2.2.3.3. Định tính alkaloid[2].
* Các thuốc thử sử dụng. - Thuốc thử Dragendorff.
Dung dịch A: Hòa tan 0.05 g bismuth nitrate (Bi(NO3)3.5H2O) trong 20 ml dung dịch acetic acid 20%. Dung dịch B: 5 ml dung dịch KI 40% trong nước. Trước khi sử dụng, trộn 20 ml dung dịch A, 5 ml dung dịch B và 70 ml H2O.
- Thuốc thử Mayer.
Dung dịch A: hòa tan 1,36 g HgCl2 trong 60 ml H2O. Dung dịch B: Hòa tan 5 g KI trong 10 ml H2O. Trộn hai dung dịch lại, thêm nước cất vào cho vừa đủ 100ml.
* Thí nghiệm: Lấy 0,05 g cặn chiết cho thêm 5 ml H2SO4 5%, khuấy đều rồi lọc qua giấy lọc. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml nước lọc acid rồi thêm:
+ Ống 1: 1-2 giọt thuốc thử Dragendorff, xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính.
+ Ống 2: 3-5 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. * Hiện tượng:
+ Ống 1: Dung dịch chuyển sang màu da cam. + Ống 2: Xuất hiện kết tủa trắng.
2.2.3.4. Định tính các Courmarin[2].
* Thuốc thử: Dung dịch NaOH 10%.
* Thí nghiệm: Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2 ml dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến khi sôi, sau đó lấy ra để nguội rồi thêm vào 4 ml nước cất. Nếu dung dịch ở ống 2 trong hơn ống 1 có thể xem là dương tính. Mặt khác nếu tiếp tục đem acid hóa ống 2 bằng một vài giọt dung dịch acid HCl đậm đặc, nếu dung dịch trong suốt có xuất hiện vẩn đục và có khả năng tạo kết tủa là dương tính với courmarin.
2.2.3.5. Phản ứng của Steroid[2].
- Thuốc thử: Dung dịch Liebermann-Burchard.
- Thí nghiệm: Hòa tan cao tổng trong ethanol. Lấy 1ml dung dịch này cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài giọt thuốc thử Liebermann-Burchard. Nếu dung dịch chuyển thành màu xanh dương, lục, cam hoặc đỏ, các màu này thường rất bền không bị đổi theo thời gian; thì chứng tỏ mẫu nghiên cứu có steroid.
2.2.4. Xác định cấu trúc các chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H, cacbon 13C, phổ hai chiều HSQC và HMBC, NOESY và phổ khối lượng ESI-MS.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được đo tại Khoa Hóa học - Đại Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội. Phổ khối lượng thực hiện tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam.
2.3. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư
2.3.1. Vật liệu và hóa chất
-FBS của GIBCO, Invitrogen, TCA (Sigma), sRB (Sigma)
-Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad).
- Chất tham khảo: Ellipticine. - Các hóa chất thông thường khác.
- Các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, GIBCO, Invitrogen, Promega v.v.
- Các dòng tế bào do GS. J M Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US cung cấp.
- Các dòng tế bào sử dụng trong nghiên cứu:
+ A549: Ung thư phổi ở người (human lung carcinoma). + Hela: Ung thư buồng trứng (human ovarian carcinoma).
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro
-Các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1.0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum - FBS (GIBCO).
-Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37℃, 5% CO2.
2.3.3. Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay)
Phương pháp thử độ độc tế bào ung thư in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp
của Monks (1991). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD - Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
-Chất thử được pha thành các dải nồng độ thích hợp.
-Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.
-Chất thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 µg/ml; 20 µg/ml; 4 µg/ml và 0.8 µg/ml.
-Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (180µl) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào